Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար: Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Թերմոֆիլները միկրոօրգանիզմներ են, որոնք զարգանում են բարձր ջերմաստիճանի պայմաններում: Նրանց ուսումնասիրությունը կարող է արժեքավոր տեղեկություններ տալ այն մասին, թե ինչպես է կյանքը հարմարվում ծայրահեղ պայմաններին: Այնուամենայնիվ, դժվար է հասնել բարձր ջերմաստիճանի պայմանների սովորական օպտիկական մանրադիտակներով: Առաջարկվել են մի քանի տնական լուծումներ, որոնք հիմնված են տեղական դիմադրողական էլեկտրական ջեռուցման վրա, սակայն պարզ կոմերցիոն լուծում չկա: Այս հոդվածում մենք ներկայացնում ենք մանրադիտակի տեսադաշտի վրա միկրոմաշտաբով լազերային տաքացման հայեցակարգը, որպեսզի ապահովի բարձր ջերմաստիճան ջերմաֆիլների ուսումնասիրության համար՝ միաժամանակ օգտագործողի միջավայրը մեղմ պահելով: Լազերային չափավոր ինտենսիվությամբ միկրոմաշտաբով ջեռուցում կարելի է ձեռք բերել՝ օգտագործելով ոսկու նանոմասնիկներով պատված ենթաշերտը որպես կենսահամատեղելի և արդյունավետ լույսի կլանիչ: Քննարկվում են միկրոմաշտաբով հեղուկի կոնվեկցիայի, բջիջների պահպանման և կենտրոնախույս ջերմաֆորետիկ շարժման հնարավոր ազդեցությունները: Մեթոդը ցուցադրվել է երկու տեսակի մեջ. (i) Geobacillus stearothermophilus, ակտիվ ջերմաֆիլ բակտերիա, որը բազմանում է մոտ 65°C ջերմաստիճանում, որը մենք դիտարկել ենք, որ բողբոջում է, աճում և լողում միկրոսանդղակի տաքացման տակ. (ii) Thiobacillus sp., օպտիմալ հիպերթերմոֆիլ արխեա: 80°C-ում: Այս աշխատանքը ճանապարհ է հարթում թերմոֆիլ միկրոօրգանիզմների պարզ և անվտանգ դիտարկման համար՝ օգտագործելով ժամանակակից և մատչելի միկրոսկոպիկ գործիքներ:
Միլիարդավոր տարիների ընթացքում կյանքը Երկրի վրա զարգացել է՝ հարմարվելու շրջակա միջավայրի մի շարք պայմաններին, որոնք երբեմն համարվում են ծայրահեղ մեր մարդկային տեսանկյունից: Մասնավորապես, որոշ ջերմաֆիլ միկրոօրգանիզմներ (բակտերիաներ, արխեաներ, սնկեր), որոնք կոչվում են թերմոֆիլներ, զարգանում են 45°C-ից մինչև 122°C1, 2, 3, 4 ջերմաստիճանի միջակայքում: կամ հրաբխային տարածքներ: Նրանց հետազոտությունները մեծ հետաքրքրություն են առաջացրել վերջին մի քանի տասնամյակների ընթացքում առնվազն երկու պատճառով: Նախ, մենք կարող ենք սովորել դրանցից, օրինակ, թե ինչպես են թերմոֆիլները 5, 6, ֆերմենտներ 7, 8 և մեմբրաններ 9-ը կայուն են նման բարձր ջերմաստիճաններում, կամ ինչպես են ջերմաֆիլները կարող դիմակայել ճառագայթման ծայրահեղ մակարդակին10: Երկրորդ, դրանք հիմք են հանդիսանում բազմաթիվ կարևոր կենսատեխնոլոգիական կիրառությունների համար1,11,12, ինչպիսիք են վառելիքի արտադրությունը13,14,15,16, քիմիական սինթեզը (դիհիդրո, սպիրտներ, մեթան, ամինաթթուներ և այլն)17, բիոարդյունահանումը18 և ջերմակայուն կենսակատալիզատորները7,11, 13. Մասնավորապես, ներկայումս հայտնի պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR)19 ներառում է մի ֆերմենտ (Taq պոլիմերազ), որը մեկուսացված է Thermus aquaticus ջերմաֆիլ բակտերիայից, որը հայտնաբերված առաջին ջերմաֆիլներից է:
Այնուամենայնիվ, թերմոֆիլների ուսումնասիրությունը հեշտ գործ չէ և չի կարող իմպրովիզացվել որևէ կենսաբանական լաբորատորիայում: Մասնավորապես, կենդանի թերմոֆիլները չեն կարող դիտվել in vitro որևէ ստանդարտ լուսային մանրադիտակով, նույնիսկ առևտրային հասանելի ջեռուցման խցիկներով, որոնք սովորաբար գնահատվում են մինչև 40°C ջերմաստիճանի համար: 1990-ականներից միայն մի քանի հետազոտական խմբեր են իրենց նվիրել բարձր ջերմաստիճանի միկրոսկոպիայի (HTM) համակարգերի ներդրմանը: 1994 թվականին Գլուխը և այլք. Ջեռուցման/սառեցման խցիկը ստեղծվել է Peltier բջիջի օգտագործման հիման վրա, որը վերահսկում է ուղղանկյուն մազանոթների ջերմաստիճանը, որը փակ է անաէրոբությունը պահպանելու համար 20: Սարքը կարող է տաքացնել մինչև 100 °C 2 °C/վ արագությամբ, ինչը թույլ է տալիս հեղինակներին ուսումնասիրել Thermotoga maritima21 հիպերթերմոֆիլ մանրէի շարժունակությունը։ 1999 թվականին Հորնը և այլք. Շատ նմանատիպ սարք է մշակվել, որը դեռևս հիմնված է տաքացվող մազանոթների օգտագործման վրա, որոնք հարմար են առևտրային մանրադիտակի համար՝ բջիջների բաժանումը/միացումը ուսումնասիրելու համար: Երկար հարաբերական անգործությունից հետո արդյունավետ HTM-ների որոնումները վերսկսվեցին 2012-ին, մասնավորապես Wirth խմբի մի շարք փաստաթղթերի հետ կապված, որոնք օգտագործում էին Հորն և այլոց կողմից հայտնագործված սարքը: Տասնհինգ տարի առաջ մեծ թվով արխեաների, այդ թվում՝ հիպերտերմոֆիլների շարժունակությունը ուսումնասիրվել է մինչև 100°C ջերմաստիճանում՝ օգտագործելով տաքացված մազանոթներ23,24: Նրանք նաև փոփոխել են սկզբնական մանրադիտակը՝ հասնելու ավելի արագ տաքացման (մի քանի րոպե 35 րոպեի փոխարեն սահմանված ջերմաստիճանին հասնելու համար) և հասնել գծային ջերմաստիճանի գրադիենտ ավելի քան 2 սմ ողջ միջավայրում: Ջերմաստիճանի գրադիենտ ձևավորող այս սարքը (TGFD) օգտագործվել է բազմաթիվ թերմոֆիլների շարժունակությունը ջերմաստիճանի գրադիենտներում կենսաբանորեն համապատասխան հեռավորությունների վրա ուսումնասիրելու համար 24, 25:
Փակ մազանոթները տաքացնելը կենդանի թերմոֆիլներին դիտարկելու միակ միջոցը չէ։ 2012 թվականին Քուվաբարա և այլք. Օգտագործվել են տնական միանգամյա օգտագործման Pyrex խցիկներ, որոնք կնքված են ջերմակայուն սոսինձով (Super X2; Cemedine, Ճապոնիա): Նմուշները տեղադրվել են առևտրով հասանելի թափանցիկ ջեռուցման ափսեի վրա (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan), որը կարող է տաքանալ մինչև 110°C, բայց ի սկզբանե նախատեսված չէ բիոպատկերի համար: Հեղինակները դիտարկել են անաէրոբ ջերմաֆիլ բակտերիաների արդյունավետ բաժանումը (Thermosipho globiformans, կրկնապատկման ժամանակը 24 րոպե) 65°C ջերմաստիճանում: 2020 թվականին Պուլշենը և այլք. Առևտրային մետաղական սպասքի արդյունավետ ջեռուցումը (AttofluorTM, Thermofisher) ցուցադրվել է երկու տնական ջեռուցման տարրերի միջոցով՝ կափարիչ և բեմ (PCR մեքենայով ներշնչված կոնֆիգուրացիա): Այս ասոցիացիան հանգեցնում է հեղուկի միատեսակ ջերմաստիճանի և կանխում է գոլորշիացումը և խտացումը կափարիչի ներքևում: O-ring-ի օգտագործումը թույլ չի տալիս գազի փոխանակումը շրջակա միջավայրի հետ: Այս HTM-ը, որը կոչվում է Sulfoscope, օգտագործվել է Sulfolobus acidocaldarius-ը պատկերելու համար 75°C27 ջերմաստիճանում:
Այս բոլոր համակարգերի ճանաչված սահմանափակումը օդային օբյեկտների օգտագործման սահմանափակումն էր, քանի որ ցանկացած նավթի ընկղմում հարմար չէ նման բարձր ջերմաստիճանի և ավելի քան 1 մմ հաստությամբ թափանցիկ նմուշների միջոցով պատկերման համար: Այս բոլոր համակարգերի ճանաչված սահմանափակումը օդային օբյեկտների օգտագործման սահմանափակումն էր, քանի որ ցանկացած նավթի ընկղմում հարմար չէ նման բարձր ջերմաստիճանի և ավելի քան 1 մմ հաստությամբ թափանցիկ նմուշների միջոցով պատկերման համար: Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничивание на использование воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокизациой температуры и для резы 1 մմ Այս բոլոր համակարգերի ճանաչված թերությունը օդային օբյեկտների օգտագործման սահմանափակումն էր, քանի որ ցանկացած յուղի ընկղմում հարմար չէր նման բարձր ջերմաստիճանի և ավելի քան 1 մմ հաստությամբ թափանցիկ նմուշների միջոցով տեսանելիության համար:所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合过限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合迿口毫米厚的透明样品成像. Այս բոլոր համակարգերի ճանաչված սահմանափակումը օդափոխվող հայելի օգտագործելու սահմանափակումն է, քանի որ ցանկացած յուղի ընկղմում հարմար չէ 1 մմ հաստությամբ թափանցիկ նմուշներ նման բարձր ջերմաստիճաններում պատկերելու համար: Общепризнанным недостатком всех этих систем является սահմանափակ է օգտագործել օդային օդը, любое иммерсионное погружение в масло непригодно для таких высоких температур и визулизации черезы >1. Այս բոլոր համակարգերի ճանաչված թերությունը օդային ոսպնյակների սահմանափակ օգտագործումն է, ցանկացած յուղի ընկղմում հարմար չէ նման բարձր ջերմաստիճանների և ավելի քան 1 մմ հաստությամբ թափանցիկ նմուշների միջոցով արտացոլման համար:Վերջերս այս սահմանափակումը չեղարկվեց Չարլզ-Օրզագի և այլոց կողմից: 28-ը, ով մշակել է սարք, որն այլևս չի ապահովում ջերմություն հետաքրքրող համակարգի շուրջ, այլ ավելի շուտ ծածկույթի ապակու ներսում՝ ծածկված ITO-ից (ինդիում-անագ օքսիդ) պատրաստված ռեզիստորի բարակ թափանցիկ շերտով: Կափարիչը կարելի է տաքացնել մինչև 75 °C՝ թափանցիկ շերտի միջով էլեկտրական հոսանք անցնելու միջոցով։ Այնուամենայնիվ, հեղինակը պետք է նաև տաքացնի ոսպնյակը մինչև օբյեկտիվը, բայց ոչ ավելի, քան 65 °C, որպեսզի այն չվնասվի:
Այս աշխատանքները ցույց են տալիս, որ արդյունավետ բարձր ջերմաստիճանի օպտիկական մանրադիտակի մշակումը լայնորեն ընդունված չէ, հաճախ պահանջում է տնական սարքավորում և հաճախ ձեռք է բերվում տարածական լուծարման գնով, ինչը լուրջ թերություն է՝ հաշվի առնելով, որ ջերմաֆիլ միկրոօրգանիզմները մի քանիից ավելի չեն։ միկրոմետրեր: Ջեռուցման կրճատված ծավալը HTM-ի երեք բնորոշ խնդիրների լուծման բանալին է՝ վատ տարածական լուծում, բարձր ջերմային իներցիա, երբ համակարգը տաքանում է, և շրջակա տարրերի վնասակար ջեռուցում (սուզվող յուղ, օբյեկտիվ ոսպնյակ… կամ օգտագործողի ձեռքեր) ծայրահեղ ջերմաստիճանում: ).
Այս հոդվածում մենք ներկայացնում ենք HTM ջերմաֆիլների դիտարկման համար, որը հիմնված չէ դիմադրողական ջեռուցման վրա: Փոխարենը, մենք հասանք տեղայնացված տաքացման մանրադիտակի տեսադաշտի սահմանափակ հատվածում լույս կլանող ենթաշերտի լազերային ճառագայթման միջոցով: Ջերմաստիճանի բաշխումը տեսանելի է եղել՝ օգտագործելով քանակական փուլային մանրադիտակ (QPM): Այս մեթոդի արդյունավետությունը ցույց են տալիս Geobacillus stearothermophilus-ը՝ շարժական ջերմաֆիլ մանրէ, որը բազմանում է մոտ 65°C ջերմաստիճանում և ունի կարճ կրկնապատկման ժամանակ (մոտ 20 րոպե), և Sulfolobus shibatae՝ հիպերթերմոֆիլ, որը օպտիմալ կերպով աճում է 80°C-ում (archae) նկարազարդելու համար։ Վերարտադրման նորմալ արագությունը և լողալը դիտվել են որպես ջերմաստիճանի ֆունկցիա: Այս լազերային HTM (LA-HTM) չի սահմանափակվում ծածկույթի հաստությամբ կամ օբյեկտի բնույթով (օդ կամ յուղի ընկղմում): Սա թույլ է տալիս օգտագործել շուկայում առկա ցանկացած բարձր լուծաչափով ոսպնյակ: Այն նաև չի տուժում ջերմային իներցիայի պատճառով դանդաղ տաքացումից (հասնում է ակնթարթային տաքացում միլիվայրկյան մասշտաբով) և օգտագործում է միայն կոմերցիոն հասանելի բաղադրիչներ: Անվտանգության միակ նոր մտահոգությունները կապված են հզոր լազերային ճառագայթների առկայության հետ (սովորաբար մինչև 100 մՎտ) սարքի ներսում և, հնարավոր է, աչքերի միջոցով, որոնք պահանջում են պաշտպանիչ ակնոցներ:
LA-HTM-ի սկզբունքն է օգտագործել լազեր՝ նմուշը տեղում տաքացնելու համար մանրադիտակի տեսադաշտում (նկ. 1ա): Դա անելու համար նմուշը պետք է լույսը կլանող լինի: Խելամիտ լազերային հզորություն (100 մՎտ-ից պակաս) օգտագործելու համար մենք չենք հիմնվել հեղուկ միջավայրի լույսի կլանման վրա, այլ արհեստականորեն մեծացրել ենք նմուշի կլանումը՝ հիմքը ոսկու նանոմասնիկներով պատելով (նկ. 1գ): Ոսկու նանոմասնիկները լույսով տաքացնելը հիմնարար նշանակություն ունի ջերմային պլազմոնիկայի ոլորտում՝ կենսաբժշկության, նանոքիմիայի կամ արևի լույսի հավաքման ակնկալվող կիրառություններով29,30,31: Վերջին մի քանի տարիների ընթացքում մենք օգտագործել ենք այս LA-HTM-ը ֆիզիկայի, քիմիայի և կենսաբանության մեջ ջերմային պլազմայի կիրառման հետ կապված մի շարք ուսումնասիրությունների մեջ: Այս մեթոդի հիմնական դժվարությունը վերջնական ջերմաստիճանի պրոֆիլը ցուցադրելն է, քանի որ բարձր ջերմաստիճանը սահմանափակվում է նմուշի ներսում գտնվող միկրոմաշտաբով: Մենք ցույց ենք տվել, որ ջերմաստիճանի քարտեզագրումը կարող է իրականացվել չորս ալիքի լայնակի կտրվածքային ինտերֆերոմետրի միջոցով, որը քանակական ֆազային մանրադիտակի պարզ, բարձր լուծաչափով և շատ զգայուն մեթոդ է, որը հիմնված է երկչափ դիֆրակցիոն ցանցերի օգտագործման վրա (հայտնի է նաև որպես խաչաձև ցանցեր): 33,34,35,36. Ջերմային մանրադիտակի այս տեխնիկայի հուսալիությունը, որը հիմնված է խաչաձև ալիքային ալիքի մանրադիտակի վրա (CGM), ցուցադրվել է վերջին տասնամյակի ընթացքում հրապարակված տասնյակ աշխատություններում37,38,39,40,41,42,43:
Զուգահեռ լազերային ջեռուցման, ձևավորման և ջերմաստիճանի մանրադիտակի տեղադրման սխեման. b Նմուշի երկրաչափություն, որը բաղկացած է AttofluorTM խցիկից, որը պարունակում է ոսկու նանոմասնիկներով պատված ծածկույթ: գ Ուշադիր նայեք նմուշին (ոչ մասշտաբով): d-ը ներկայացնում է լազերային ճառագայթի միատեսակ պրոֆիլը և (ե) ոսկու նանոմասնիկների նմուշի հարթության վրա նմանակված ջերմաստիճանի հետագա բաշխումը: f-ն օղակաձև լազերային ճառագայթի պրոֆիլ է, որը հարմար է միատեսակ ջերմաստիճան ստեղծելու համար, ինչպես ցույց է տրված (g) արդյունքում ստացված ջերմաստիճանի բաշխման մոդելավորումը: Սանդղակի սանդղակ՝ 30 մկմ:
Մասնավորապես, վերջերս մենք հասել ենք կաթնասունների բջիջների տաքացմանը LA-HTM և CGM-ով և հետևել բջջային ջերմային ցնցումների արձագանքներին 37-42°C միջակայքում՝ ցույց տալով այս տեխնիկայի կիրառելիությունը միայնակ կենդանի բջիջների պատկերման համար: Այնուամենայնիվ, LA-HTM-ի կիրառումը բարձր ջերմաստիճանում միկրոօրգանիզմների ուսումնասիրության համար միանշանակ չէ, քանի որ այն ավելի շատ զգուշություն է պահանջում կաթնասունների բջիջների համեմատ. դեպի ուժեղ ուղղահայաց ջերմաստիճանի գրադիենտ: կարող է ստեղծել հեղուկի կոնվեկցիա 44, որը, եթե ամուր կցված չէ հիմքին, կարող է առաջացնել բակտերիաների անցանկալի շարժում և խառնում: Այս կոնվեկցիան կարող է վերացվել հեղուկ շերտի հաստությունը նվազեցնելու միջոցով: Այդ նպատակով, ստորև ներկայացված բոլոր փորձերում, բակտերիալ կախոցները տեղադրվել են մոտավորապես 15 մկմ հաստությամբ երկու ծածկոցների միջև, որոնք տեղադրված են մետաղական բաժակի ներսում (AttofluorTM, Thermofisher, Նկար 1b,c): Սկզբունքորեն, կոնվեկցիայից կարելի է խուսափել, եթե հեղուկի հաստությունը ավելի փոքր է, քան ջեռուցման լազերի ճառագայթի չափը: Երկրորդ, նման սահմանափակ երկրաչափության մեջ աշխատելը կարող է խեղդել աերոբ օրգանիզմները (տես նկ. S2): Այս խնդրից կարելի է խուսափել թթվածնի (կամ ցանկացած այլ կենսական գազի) համար թափանցելի ենթաշերտի օգտագործմամբ, ծածկապատման շերտի ներսում թակարդված օդային պղպջակներ թողնելով կամ վերին ծածկի վրա անցքեր փորելով (տես նկ. S1) 45: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ընտրեցինք վերջին լուծումը (Նկարներ 1b և S1): Վերջապես, լազերային ջեռուցումը չի ապահովում ջերմաստիճանի միասնական բաշխում: Նույնիսկ լազերային ճառագայթի նույն ինտենսիվության դեպքում (նկ. 1դ), ջերմաստիճանի բաշխումը միատեսակ չէ, այլ ավելի շուտ նման է Գաուսի բաշխմանը ջերմային դիֆուզիայի պատճառով (նկ. 1e): Երբ նպատակը կենսաբանական համակարգերի ուսումնասիրման համար տեսադաշտում ճշգրիտ ջերմաստիճաններ հաստատելն է, անհավասար պրոֆիլները իդեալական չեն և կարող են նաև հանգեցնել բակտերիաների ջերմաֆորետիկ շարժմանը, եթե դրանք չեն կպչում ենթաշերտին (տես նկ. S3, S4)39: Այդ նպատակով մենք օգտագործեցինք տարածական լույսի մոդուլատոր (SLM)՝ ինֆրակարմիր լազերային ճառագայթը ձևավորելու համար՝ ըստ նմուշի հարթության օղակի ձևի (նկ. 1f), որպեսզի հասնենք ջերմաստիճանի կատարյալ միատեսակ բաշխմանը տվյալ երկրաչափական տարածքում, չնայած ջերմային դիֆուզիային (նկ. 1դ) 39, 42, 46: Տեղադրեք վերին ծածկը մետաղյա ափսեի վրա (Նկար 1b), որպեսզի խուսափեք միջավայրի գոլորշիացումից և դիտեք առնվազն մի քանի օր: Քանի որ այս վերին ծածկը կնքված չէ, անհրաժեշտության դեպքում ցանկացած պահի կարող է հեշտությամբ ավելացվել լրացուցիչ կրիչ:
Ցույց տալու համար, թե ինչպես է աշխատում LA-HTM-ը և ցուցադրելու դրա կիրառելիությունը ջերմաֆիլ հետազոտություններում, մենք ուսումնասիրեցինք Geobacillus stearothermophilus-ի աերոբ բակտերիաները, որոնք ունեն մոտ 60-65°C աճի օպտիմալ ջերմաստիճան: Բակտերիան ունի նաև դրոշակներ և լողալու ունակություն՝ ապահովելով բջջային նորմալ գործունեության ևս մեկ ցուցանիշ:
Նմուշները (նկ. 1b) նախապես ինկուբացվել են 60°C-ում մեկ ժամով, այնուհետև տեղադրվել LA-HTM նմուշի պահարանում: Այս նախնական ինկուբացիան կամընտիր է, բայց դեռևս օգտակար է երկու պատճառով. Առաջինը, երբ լազերը միացված է, այն հանգեցնում է բջիջների անմիջապես աճի և բաժանման (տես M1 ֆիլմը Լրացուցիչ նյութերում): Առանց նախնական ինկուբացիայի, բակտերիաների աճը սովորաբար հետաձգվում է մոտ 40 րոպեով ամեն անգամ, երբ նոր դիտման տարածքը տաքացվում է նմուշի վրա: Երկրորդը, 1 ժամ տեւած նախնական ինկուբացիան նպաստեց բակտերիաների կպչունությանը ծածկույթին` կանխելով բջիջների դուրս գալը տեսադաշտից թերմոֆորեզի պատճառով, երբ լազերը միացված էր (տես M2 ֆիլմը Լրացուցիչ նյութերում): Ջերմոֆորեզը մասնիկների կամ մոլեկուլների շարժումն է ջերմաստիճանի գրադիենտի երկայնքով, սովորաբար տաքից սառը, և բակտերիաները բացառություն չեն43,47: Այս անցանկալի ազդեցությունը վերացվում է տվյալ տարածքում՝ օգտագործելով SLM՝ լազերային ճառագայթը ձևավորելու և ջերմաստիճանի հարթ բաշխման հասնելու համար:
Նկ. Նկար 2-ը ցույց է տալիս ջերմաստիճանի բաշխումը, որը չափվում է CGM-ով, որը ստացվում է ոսկու նանոմասնիկներով պատված ապակե հիմքի ճառագայթման միջոցով օղակաձև լազերային ճառագայթով (նկ. 1f): Լազերային ճառագայթով ծածկված ողջ տարածքում նկատվել է ջերմաստիճանի հարթ բաշխում: Այս գոտին սահմանվել է 65°C՝ աճի օպտիմալ ջերմաստիճան: Այս շրջանից դուրս ջերմաստիճանի կորը բնականաբար ընկնում է \(1/r\)-ի (որտեղ \(r\)-ը ճառագայթային կոորդինատն է):
CGM չափումների ջերմաստիճանի քարտեզ, որը ստացվել է օղակաձև լազերային ճառագայթի միջոցով՝ ոսկու նանոմասնիկների շերտը ճառագայթելու համար՝ շրջանաձև տարածքի վրա հարթ ջերմաստիճանի պրոֆիլ ստանալու համար: բ Ջերմաստիճանի քարտեզի իզոթերմ (ա). Լազերային ճառագայթի ուրվագիծը ներկայացված է մոխրագույն կետավոր շրջանով: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ (տես Լրացուցիչ նյութեր, նկար S4):
Բակտերիալ բջիջների կենսունակությունը վերահսկվել է մի քանի ժամվա ընթացքում՝ օգտագործելով LA-HTM: Նկ. 3-ը ցույց է տալիս 3 ժամ 20 րոպեանոց ֆիլմից արված չորս պատկերների ժամանակային միջակայքը (Ֆիլմ M3, Լրացուցիչ տեղեկություններ): Դիտարկվել է, որ բակտերիաները ակտիվորեն բազմանում են լազերի կողմից սահմանված շրջանաձև հատվածում, որտեղ ջերմաստիճանը օպտիմալ էր՝ մոտենալով 65°C-ին: Ի հակադրություն, բջիջների աճը զգալիորեն կրճատվել է, երբ ջերմաստիճանը 10 վայրկյանում իջել է 50°C-ից ցածր:
G. stearothermophilus բակտերիաների օպտիկական խորության պատկերներ, որոնք աճում են լազերային տաքացումից հետո տարբեր ժամանակներում, (ա) t = 0 րոպե, (բ) 1 ժ 10 րոպե, (գ) 2 ժ 20 րոպե, (դ) 3 ժ 20 րոպե, դուրս 200 Քաղված է մեկ րոպեանոց ֆիլմից (M3 ֆիլմը ներկայացված է Լրացուցիչ տեղեկություններում), որը տեղադրված է համապատասխան ջերմաստիճանի քարտեզի վրա: Լազերը միանում է \(t=0\) ժամանակին: Ինտենսիվության պատկերին ավելացվել են իզոթերմներ։
Բջիջների աճը և դրա կախվածությունը ջերմաստիճանից ավելի քանակականացնելու համար մենք չափեցինք ի սկզբանե մեկուսացված բակտերիաների տարբեր գաղութների կենսազանգվածի աճը Movie M3 տեսադաշտում (նկ. 4): Մինի գաղութների ձևավորման միավորի (mCFU) ձևավորման սկզբում ընտրված մայր բակտերիաները ներկայացված են Նկար S6-ում: Չոր զանգվածի չափումները կատարվել են CGM 48 տեսախցիկով, որն օգտագործվել է ջերմաստիճանի բաշխումը քարտեզագրելու համար: Չոր քաշը և ջերմաստիճանը չափելու CGM-ի կարողությունը LA-HTM-ի ուժն է: Ինչպես և սպասվում էր, բարձր ջերմաստիճանը բակտերիաների ավելի արագ աճի պատճառ դարձավ (նկ. 4ա): Ինչպես ցույց է տրված նկ. 4b-ի կիսագրանցային գծապատկերում, բոլոր ջերմաստիճաններում աճը հաջորդում է էքսպոնենցիալ աճին, որտեղ տվյալներն օգտագործում են էքսպոնենցիալ \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ էքսպոնենցիալ ֆունկցիան: {{ \mbox{cst}}}\), որտեղ \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – գեներացման ժամանակը (կամ կրկնապատկման ժամանակը), \(g =1/ \tau\) – աճի տեմպ (բաժանումների քանակը միավոր ժամանակում): Նկ. 4c-ը ցույց է տալիս համապատասխան աճի տեմպը և առաջացման ժամանակը` որպես ջերմաստիճանի ֆունկցիա: Արագ աճող mCFU-ները բնութագրվում են երկու ժամից հետո աճի հագեցմամբ, ակնկալվող վարքագիծ բակտերիաների բարձր խտության պատճառով (նման է դասական հեղուկ մշակույթների ստացիոնար փուլին): Ընդհանուր ձևը \(g\left(T\right)\) (նկ. 4c) համապատասխանում է G. stearothermophilus-ի ակնկալվող երկփուլ կորին՝ մոտ 60-65°C աճի օպտիմալ արագությամբ: Համապատասխանեցրեք տվյալները՝ օգտագործելով կարդինալ մոդելը (Նկար S5)49, որտեղ \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, որը լավ համընկնում է գրականության մեջ նշված այլ արժեքների հետ49: Չնայած ջերմաստիճանից կախված պարամետրերը վերարտադրելի են, \({G}_{0}\)-ի առավելագույն աճի տեմպը կարող է տարբեր լինել մեկ փորձից մյուսը (տես նկարները S7-S9 և ֆիլմը M4): Ի տարբերություն ջերմաստիճանի հարմարեցման պարամետրերի, որոնք պետք է համընդհանուր լինեն, աճի առավելագույն տեմպը կախված է միջավայրի հատկություններից (սննդանյութերի առկայություն, թթվածնի կոնցենտրացիան) դիտարկվող միկրոսանդղակի երկրաչափության շրջանակներում:
մի մանրէների աճ տարբեր ջերմաստիճաններում: mCFU. Մանրանկարչական գաղութների ձևավորման միավորներ: Տվյալները ստացվել են ջերմաստիճանի գրադիենտում աճող մեկ մանրէի տեսանյութից (ֆիլմ M3): b Նույնը, ինչ (ա), կիսալոգարիթմական սանդղակը: c Աճի տեմպ\(\tau\) և առաջացման ժամանակը\(g\) հաշվարկված գծային ռեգրեսիայից (b): Հորիզոնական սխալի գծեր. ջերմաստիճանի միջակայք, որի ընթացքում mCFU-ները աճի ընթացքում ընդլայնվել են դեպի տեսադաշտ: Ուղղահայաց սխալի գծեր. գծային ռեգրեսիայի ստանդարտ սխալ:
Բացի նորմալ աճից, որոշ բակտերիաներ երբեմն լողում էին տեսադաշտում լազերային տաքացման ժամանակ, ինչը սպասելի վարքագիծ է դրոշակ ունեցող բակտերիաների համար: M5 ֆիլմը լրացուցիչ տեղեկություններում ցույց է տալիս լողի նման զբաղմունքները։ Այս փորձի ժամանակ օգտագործվել է միատեսակ լազերային ճառագայթում ջերմաստիճանի գրադիենտ ստեղծելու համար, ինչպես ցույց է տրված 1d, e և S3 նկարներում: Նկար 5-ը ցույց է տալիս M5 ֆիլմից ընտրված երկու պատկերների հաջորդականություն, որոնք ցույց են տալիս, որ մեկ բակտերիա ցուցադրում է ուղղորդված շարժում, մինչդեռ մնացած բոլոր բակտերիաները մնում են անշարժ:
Երկու ժամանակային շրջանակները (ա) և (բ) ցույց են տալիս երկու տարբեր բակտերիաների լողալը, որոնք նշված են կետավոր շրջանակներով: Պատկերները վերցված են M5 ֆիլմից (տրամադրվում է որպես լրացուցիչ նյութ):
G. stearothermophilus-ի դեպքում բակտերիաների ակտիվ շարժումը (նկ. 5) սկսվել է լազերային ճառագայթը միացնելուց մի քանի վայրկյան անց։ Այս դիտարկումը ընդգծում է այս ջերմաֆիլ միկրոօրգանիզմի ժամանակավոր արձագանքը ջերմաստիճանի բարձրացմանը, ինչպես արդեն նկատվել է Mora et al. 24 . Բակտերիաների շարժունակության և նույնիսկ թերմոտաքսի թեման կարող է հետագայում ուսումնասիրվել LA-HTM-ի միջոցով:
Մանրէաբանական լողը չպետք է շփոթել ֆիզիկական շարժման այլ տեսակների հետ, մասնավորապես՝ (i) Բրոունյան շարժումը, որը կարծես քաոսային շարժում է՝ առանց որոշակի ուղղության, (ii) կոնվեկցիա 50 և ջերմաֆորեզ 43, որը բաղկացած է ջերմաստիճանի երկայնքով շարժման կանոնավոր շեղումից։ գրադիենտ.
G. stearothermophilus-ը հայտնի է բարձր դիմացկուն սպորներ (սպորի ձևավորում) առաջացնելու ունակությամբ, երբ ենթարկվում է շրջակա միջավայրի անբարենպաստ պայմաններին որպես պաշտպանություն: Երբ շրջակա միջավայրի պայմանները կրկին բարենպաստ են դառնում, սպորները բողբոջում են՝ ձևավորելով կենդանի բջիջներ և վերսկսելով աճը։ Չնայած այս սպորացման/բողբոջման գործընթացը լավ հայտնի է, այն երբեք իրական ժամանակում չի դիտարկվել: Օգտագործելով LA-HTM, մենք այստեղ հայտնում ենք G. stearothermophilus-ի բողբոջման իրադարձությունների առաջին դիտարկումը:
Նկ. 6a-ը ցույց է տալիս օպտիկական խորության (OT) պատկերները, որոնք ստացվել են 13 սպորներից բաղկացած CGM հավաքածուի միջոցով: Ամբողջ հավաքման ժամանակի ընթացքում (15 ժ 6 րոպե, \(t=0\) – լազերային տաքացման սկիզբ), 13 սպորներից 4-ը բողբոջել են, հաջորդական ժամանակային կետերում \(t=2\) ժ, \( 3\) ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' և \(11\) h \(30\)': Թեև այս իրադարձություններից միայն մեկն է ներկայացված Նկար 6-ում, M6 ֆիլմում կարող են դիտվել 4 բողբոջման դեպքեր՝ լրացուցիչ նյութում: Հետաքրքիր է, որ բողբոջումը պատահական է թվում. ոչ բոլոր սպորներն են բողբոջում և չեն բողբոջում միաժամանակ՝ չնայած շրջակա միջավայրի պայմանների նույն փոփոխություններին:
Ժամանակի անցում, որը բաղկացած է 8 OT պատկերներից (յուղի ընկղմում, 60x, 1.25 NA օբյեկտ) և (բ) G. stearothermophilus ագրեգատների կենսազանգվածի էվոլյուցիան: գ (բ) Կազմված է կիսագլխավոր սանդղակով, որպեսզի ընդգծվի աճի տեմպի գծայինությունը (գծանշված գիծ):
Նկ. 6b,c-ը ցույց է տալիս տեսադաշտում բջջային պոպուլյացիաների կենսազանգվածը՝ որպես տվյալների հավաքագրման ողջ ժամանակահատվածի ժամանակի ֆունկցիա: Չոր զանգվածի արագ քայքայումը դիտված \(t=5\)ժ-ում նկ. 6b, c, տեսադաշտից որոշ բջիջների ելքի պատճառով։ Այս չորս իրադարձությունների աճի տեմպը \(0.77\pm 0.1\) h-1 է: Այս արժեքը ավելի բարձր է, քան աճի տեմպը, որը կապված է Նկար 3. 3 և 4-ի հետ, որտեղ բջիջները նորմալ են աճում: Սպորներից G. stearothermophilus-ի աճի արագության պատճառը պարզ չէ, սակայն այս չափումները ընդգծում են LA-HTM-ի հետաքրքրությունը և աշխատում են մեկ բջջի մակարդակում (կամ մեկ mCFU մակարդակում)՝ ավելին իմանալու բջջային կյանքի դինամիկայի մասին: .
LA-HTM-ի բազմակողմանիությունը և բարձր ջերմաստիճաններում դրա արդյունավետությունը հետագայում ցուցադրելու համար մենք ուսումնասիրեցինք Sulfolobus shibatae-ի աճը՝ հիպերթերմոֆիլ acidophilic արխեա, որի աճի օպտիմալ ջերմաստիճանը 80°C51 է: Համեմատած G. stearothermophilus-ի հետ, այս արխեաները նույնպես ունեն շատ տարբեր մորֆոլոգիա, որոնք նման են 1 մկմ գնդերի (կոկի), այլ ոչ թե երկարաձգված ձողերի (բացիլներ):
Նկար 7ա-ն բաղկացած է S. shibatae mCFU-ի հաջորդական օպտիկական խորության պատկերներից, որոնք ստացվել են CGM-ի միջոցով (տես M7 գեղարվեստական ֆիլմը Լրացուցիչ նյութերում): Այս mCFU-ն աճում է մոտ 73°C ջերմաստիճանում՝ 80°C-ից ցածր օպտիմալ ջերմաստիճանից, բայց ակտիվ աճի համար նախատեսված ջերմաստիճանի տիրույթում: Մենք նկատեցինք բազմաթիվ տրոհման իրադարձություններ, որոնք մի քանի ժամ հետո mCFU-ները արխեայի միկրոխաղող տեսք տվեցին: Այս OT պատկերներից mCFU կենսազանգվածը չափվել է ժամանակի ընթացքում և ներկայացված է Նկար 7b-ում: Հետաքրքիր է, որ S. shibatae mCFU-ները ցույց են տվել գծային աճ, այլ ոչ թե էքսպոնենցիալ աճ, որը նկատվել է G. stearothermophilus mCFUs-ով: Բջիջների աճի տեմպերի բնույթի վերաբերյալ երկարատև քննարկումներ են եղել 52. մինչդեռ որոշ ուսումնասիրություններ հայտնում են մանրէների աճի տեմպերը, որոնք համաչափ են դրանց չափերին (էքսպոնենցիալ աճ), մյուսները ցույց են տալիս հաստատուն արագություն (գծային կամ երկգծային աճ): Ինչպես բացատրում են Tzur-ը և այլոք.53-ը, էքսպոնենցիալ և (երկ)գծային աճը տարբերակելը պահանջում է կենսազանգվածի չափումների <6% ճշգրտություն, ինչը անհասանելի է QPM տեխնիկայի մեծ մասի համար, նույնիսկ ինտերֆերոմետրիա: Ինչպես բացատրում են Tzur-ը և այլոք.53-ը, էքսպոնենցիալ և (երկ)գծային աճը տարբերակելը պահանջում է կենսազանգվածի չափումների <6% ճշգրտություն, ինչը անհասանելի է QPM տեխնիկայի մեծ մասի համար, նույնիսկ ինտերֆերոմետրիա: Ինչպես объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует ճշտություն <6% է измерениях биомассы, что недостижимо за большинства методов QPM, որը պետք է օգտագործվի ինտերֆերոմետրերի օգտագործմամբ: Ինչպես բացատրում են Zur et al.53-ը, էքսպոնենցիալ և (երկ)գծային աճը տարբերակելը պահանջում է <6% ճշգրտություն կենսազանգվածի չափումների մեջ, ինչը անհասանելի է QPM մեթոդների մեծ մասի համար, նույնիսկ օգտագործելով ինտերֆերոմետրիա:Ինչպես բացատրում են Zur et al. 53, էքսպոնենցիալ և (երկ)գծային աճը տարբերակելը պահանջում է կենսազանգվածի չափումների 6%-ից պակաս ճշգրտություն, ինչը անհասանելի է QPM մեթոդների մեծ մասի համար, նույնիսկ երբ օգտագործվում է ինտերֆերոմետրիա: CGM-ն այս ճշտությանը հասնում է կենսազանգվածի չափումների մեջ ենթ pg ճշգրտությամբ36,48:
ժամանակի անցում, որը բաղկացած է 6 OT պատկերներից (յուղի ընկղմում, 60x, NA օբյեկտ 1.25) և (բ) միկրո-CFU կենսազանգվածի էվոլյուցիան, որը չափվում է CGM-ով: Լրացուցիչ տեղեկությունների համար տես M7 ֆիլմը:
S. shibatae-ի կատարյալ գծային աճն անսպասելի էր և դեռ չի հաղորդվել: Այնուամենայնիվ, ակնկալվում է էքսպոնենցիալ աճ, գոնե այն պատճառով, որ ժամանակի ընթացքում պետք է տեղի ունենան 2, 4, 8, 16 … բջիջների բազմակի բաժանումներ: Մենք ենթադրեցինք, որ գծային աճը կարող է պայմանավորված լինել բջիջների խիտ փաթեթավորման պատճառով բջիջների արգելակմամբ, ճիշտ այնպես, ինչպես բջիջների աճը դանդաղում է և, ի վերջո, հասնում է քնած վիճակի, երբ բջիջների խտությունը չափազանց բարձր է:
Եզրափակում ենք՝ հերթով քննարկելով հետևյալ հինգ հետաքրքիր կետերը՝ ջեռուցման ծավալի կրճատում, ջերմային իներցիայի կրճատում, հետաքրքրություն ոսկու նանոմասնիկների նկատմամբ, հետաքրքրություն քանակական ֆազային մանրադիտակով և հնարավոր ջերմաստիճանի միջակայք, որտեղ կարող է օգտագործվել LA-HTM:
Դիմադրողական ջեռուցման համեմատությամբ՝ HTM մշակման համար օգտագործվող լազերային ջեռուցումն առաջարկում է մի քանի առավելություններ, որոնք մենք ցույց ենք տալիս այս ուսումնասիրության մեջ: Մասնավորապես, միկրոսկոպի տեսադաշտում գտնվող հեղուկ միջավայրերում ջեռուցման ծավալը պահվում է մի քանի (10 մկմ) 3 ծավալի սահմաններում: Այսպիսով, միայն դիտարկված մանրէներն են ակտիվ, մինչդեռ մյուս բակտերիաները քնած են և կարող են օգտագործվել նմուշի հետագա ուսումնասիրության համար. կարիք չկա նմուշը փոխելու ամեն անգամ, երբ անհրաժեշտ է նոր ջերմաստիճան ստուգել: Բացի այդ, միկրոմաշտաբով ջեռուցումը թույլ է տալիս ուղղակիորեն ուսումնասիրել ջերմաստիճանների մեծ տիրույթը. Նկար 4c-ը ստացվել է 3-ժամյա ֆիլմից (Movie M3), որը սովորաբար պահանջում է մի քանի նմուշների պատրաստում և հետազոտություն՝ յուրաքանչյուր ուսումնասիրվող նմուշի համար: y-ը ջերմաստիճանն է, որը ներկայացնում է փորձի օրերի քանակը: Ջեռուցվող ծավալի կրճատումը նաև պահպանում է մանրադիտակի շրջապատող բոլոր օպտիկական բաղադրիչները, հատկապես օբյեկտիվ ոսպնյակը, սենյակային ջերմաստիճանում, ինչը մինչ այժմ համայնքի առջև ծառացած հիմնական խնդիրն է: LA-HTM-ը կարող է օգտագործվել ցանկացած ոսպնյակի հետ, ներառյալ՝ յուղով ընկղմվող ոսպնյակներ, և կմնա սենյակային ջերմաստիճանում նույնիսկ տեսադաշտում ծայրահեղ ջերմաստիճանի դեպքում: Լազերային ջեռուցման մեթոդի հիմնական սահմանափակումը, որը մենք հայտնում ենք այս ուսումնասիրության մեջ, այն է, որ բջիջները, որոնք չեն կպչում կամ լողում, կարող են հեռու լինել տեսադաշտից և դժվար է ուսումնասիրել: Մի լուծում կարող է լինել ցածր խոշորացման ոսպնյակների օգտագործումը մի քանի հարյուր միկրոնից ավելի բարձր ջերմաստիճանի բարձրացման համար: Այս զգուշավորությունն ուղեկցվում է տարածական լուծաչափի նվազմամբ, բայց եթե նպատակը միկրոօրգանիզմների տեղաշարժն ուսումնասիրելն է, ապա տարածական բարձր թույլտվություն չի պահանջվում։
Համակարգի ջեռուցման (և հովացման) ժամանակի սանդղակը կախված է դրա չափից, ըստ օրենքի \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), որտեղ \ (L\) ջերմության աղբյուրի բնորոշ չափն է (լազերային ճառագայթի տրամագիծը մեր ուսումնասիրության մեջ \(L\ մոտ 100\) մկմ է), \(D\) շրջակա միջավայրի ջերմային դիֆուզիոն է (միջինը մեր դեպք, ապակի և ջուր Դիֆուզիոն արագություն\(D\ մոտ 2\ապատիկ {10}^{-7}\) մ2/վրկ, հետևաբար, այս ուսումնասիրության մեջ 50 ms կարգի ժամանակային պատասխաններ, այսինքն՝ քվազի ակնթարթային): ջերմաստիճանի փոփոխություններ, կարելի է ակնկալել:
Մեր առաջարկած մեթոդը կիրառելի է ցանկացած լույս կլանող ենթաշերտի համար (օրինակ՝ ITO ծածկույթով առևտրային նմուշներ): Այնուամենայնիվ, ոսկու նանոմասնիկները ի վիճակի են ապահովել բարձր ներծծում ինֆրակարմիր և ցածր ներծծում տեսանելի տիրույթում, որոնց վերջին բնութագրերը հետաքրքրություն են ներկայացնում տեսանելի տիրույթում արդյունավետ օպտիկական դիտարկման համար, հատկապես, երբ օգտագործվում է ֆլուորեսցենտ: Բացի այդ, ոսկին կենսահամատեղելի է, քիմիապես իներտ, օպտիկական խտությունը կարող է կարգավորվել 530 նմ-ից մինչև մոտ ինֆրակարմիր, իսկ նմուշի պատրաստումը պարզ և խնայող է29:
Լայնակի վանդակաճաղի ալիքային ճակատային մանրադիտակը (CGM) թույլ է տալիս ոչ միայն ջերմաստիճանի քարտեզագրում միկրոսանդղակով, այլև կենսազանգվածի մոնիտորինգ, ինչը հատկապես օգտակար է դարձնում (եթե անհրաժեշտ չէ) LA-HTM-ի հետ համատեղ: Վերջին տասնամյակի ընթացքում մշակվել են ջերմաստիճանային մանրադիտակի այլ տեխնիկա, հատկապես կենսապատկերման ոլորտում, և դրանց մեծ մասը պահանջում է ջերմաստիճանի նկատմամբ զգայուն լյումինեսցենտային զոնդեր54,55: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդները քննադատության են ենթարկվել, և որոշ զեկույցներ չափել են բջիջների ներսում ջերմաստիճանի անիրատեսական փոփոխությունները, հնարավոր է այն փաստի պատճառով, որ ֆլյուորեսցենտը կախված է բազմաթիվ գործոններից, բացի ջերմաստիճանից: Բացի այդ, լյումինեսցենտային զոնդերի մեծ մասը անկայուն է բարձր ջերմաստիճանի դեպքում: Հետևաբար, QPM-ը և, մասնավորապես, CGM-ը ներկայացնում են իդեալական ջերմաստիճանի միկրոսկոպիայի տեխնիկա՝ օպտիկական մանրադիտակի միջոցով բարձր ջերմաստիճաններում կյանքը ուսումնասիրելու համար:
S. shibatae-ի ուսումնասիրությունները, որոնք օպտիմալ կերպով ապրում են 80°C-ում, ցույց են տալիս, որ LA-HTM-ը կարող է կիրառվել հիպերթերմոֆիլների, այլ ոչ թե պարզ թերմոֆիլների ուսումնասիրության համար: Սկզբունքորեն, LA-HTM-ի միջոցով հասանելի ջերմաստիճանների տիրույթի սահմանափակում չկա, և նույնիսկ 100°C-ից բարձր ջերմաստիճանը կարելի է հասնել մթնոլորտային ճնշման դեպքում առանց եռման, ինչպես ցույց է տալիս մեր 38 խումբը հիդրոթերմալ քիմիայի կիրառություններում մթնոլորտում: ճնշում A. Նույն կերպ ոսկու նանոմասնիկները 40 տաքացնելու համար օգտագործվում է լազեր: Այսպիսով, LA-HTM-ն ունի պոտենցիալ օգտագործելու աննախադեպ հիպերթերմոֆիլներ ստանդարտ բարձր լուծաչափով օպտիկական մանրադիտակով ստանդարտ պայմաններում (այսինքն՝ շրջակա միջավայրի սթրեսի պայմաններում):
Բոլոր փորձերն իրականացվել են ինքնաշեն մանրադիտակի միջոցով, ներառյալ Köhler լուսավորությունը (LED, M625L3, Thorlabs, 700 մՎտ), նմուշի ձեռքով xy շարժում, նպատակներ (Olympus, 60x, 0.7 NA, օդ, LUCPlanFLN60X կամ 60x, NA1: , UPLFLN60XOI), CGM տեսախցիկ (QLSI խաչաձև ցանց, 39 մկմ քայլ, 0,87 մմ Andor Zyla տեսախցիկի սենսորից)՝ ինտենսիվության և ալիքի առջևի պատկերներ ապահովելու համար, և sCMOS տեսախցիկ (ORCA Flash 4.0 V3, 16-բիթ ռեժիմ, Hamamatsu-ից)՝ ձայնագրելու համար։ տվյալները ցույց են տրված Նկար 5-ում (բակտերիալ լող): Dichroic beam splitter-ը 749 նմ BrightLine եզր է (Semrock, FF749-SDi01): Տեսախցիկի առջևի ֆիլտրը 694 կարճ անցման ֆիլտր է (FF02-694/SP-25, Semrock): Տիտանի շափյուղա լազեր (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumped tsunami laser cavity, Spectra-Physics in Fig. 2-5, հետագայում փոխարինվել է Millenia լազերով, Spectraphysics 10 W, pumped Mira լազերային խոռոչ, Coherent2, Fig. -5): 6 և 7) սահմանվում են \({{{({\rm{\lambda }}}}}=800\) նմ ալիքի երկարությունը, որը համապատասխանում է ոսկու նանոմասնիկների պլազմոնային ռեզոնանսային սպեկտրին: Տարածական լույսի մոդուլատորներ (1920 × 1152 պիքսել) գնվել են Meadowlark Optics-ից:
Cross grating wavefront microscopy (CGM) օպտիկական մանրադիտակի տեխնիկան է, որը հիմնված է երկչափ դիֆրակցիոն ցանցի (նաև հայտնի է որպես խաչաձև ցանց) համատեղելու վրա սովորական տեսախցիկի սենսորից մեկ միլիմետր հեռավորության վրա: CGM-ի ամենատարածված օրինակը, որը մենք օգտագործել ենք այս ուսումնասիրության մեջ, կոչվում է չորս ալիքի լայնակի հերթափոխի ինտերֆերոմետր (QLSI), որտեղ խաչաձև ցանցը բաղկացած է ինտենսիվության/փուլային շաշկի ձևից, որը ներկայացվել և արտոնագրվել է Primot et al-ի կողմից: 200034: Ուղղահայաց և հորիզոնական վանդակաճաղերի գծերը սենսորի վրա ստեղծում են ցանցանման ստվերներ, որոնց աղավաղումը կարող է իրական ժամանակում թվայինորեն մշակվել՝ ալիքի ճակատի օպտիկական աղավաղումը (կամ համարժեք ֆազային պրոֆիլը) ստանալու համար ընկնող լույսի: Երբ օգտագործվում է մանրադիտակի վրա, CGM տեսախցիկը կարող է ցուցադրել պատկերված օբյեկտի օպտիկական ուղու տարբերությունը, որը նաև հայտնի է որպես օպտիկական խորություն (OT), նանոմետրերի կարգի զգայունությամբ36: Ցանկացած CGM չափման ժամանակ, օպտիկական բաղադրիչների կամ ճառագայթների ցանկացած թերություն վերացնելու համար, պետք է վերցվի հիմնական հղումային OT պատկեր և հանվի հետագա ցանկացած պատկերից:
Ջերմաստիճանի մանրադիտակը կատարվել է CGM տեսախցիկի միջոցով, ինչպես նկարագրված է տեղեկանքում: 32. Մի խոսքով, հեղուկի տաքացումը փոխում է նրա բեկման ինդեքսը՝ ստեղծելով ոսպնյակի ջերմային էֆեկտ, որը աղավաղում է ընկնող ճառագայթը։ Ալիքի ճակատի այս աղավաղումը չափվում է CGM-ով և մշակվում՝ օգտագործելով ապակոնվոլյուցիոն ալգորիթմ՝ հեղուկ միջավայրում ջերմաստիճանի եռաչափ բաշխում ստանալու համար: Եթե ոսկու նանոմասնիկները հավասարաչափ բաշխված են ամբողջ նմուշում, ապա ջերմաստիճանի քարտեզագրումը կարող է կատարվել բակտերիայից զերծ տարածքներում՝ ավելի լավ պատկերներ ստանալու համար, ինչը մենք երբեմն անում ենք: Հղման CGM պատկերը ձեռք է բերվել առանց ջեռուցման (լազերային անջատումով) և այնուհետև նկարահանվել է նույն տեղում, երբ լազերը միացված է:
Չոր զանգվածի չափումը կատարվում է նույն CGM տեսախցիկով, որն օգտագործվում է ջերմաստիճանի պատկերման համար: CGM-ի տեղեկատու պատկերները ստացվել են՝ արագորեն տեղափոխելով նմուշը x և y-ով բացահայտման ընթացքում՝ որպես բակտերիաների առկայության պատճառով ՕՏ-ում ցանկացած անհամասեռությունը միջինացնելու միջոց: Բակտերիաների OT պատկերներից, դրանց կենսազանգվածը ստացվել է պատկերների անսամբլի միջոցով, որոնք ընտրվել են Matlab-ի ինքնաշեն հատվածավորման ալգորիթմի միջոցով (տես «Թվային ծածկագիր» ենթաբաժինը), հետևելով ref. 48. Մի խոսքով, մենք օգտագործում ենք \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} կապը } x{{\mbox{d}}}y\), որտեղ \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) օպտիկական խորության պատկերն է, \(m\) է չոր քաշը և \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) հաստատուն է: Մենք ընտրեցինք \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) μm3/pg, որը բնորոշ հաստատուն է կենդանի բջիջների համար:
25 մմ տրամագծով և 150 մկմ հաստությամբ ոսկու նանոմասնիկներով պատված ծածկույթը տեղադրվել է AttofluorTM խցիկում (Thermofisher)՝ ոսկու նանոմասնիկներով դեպի վեր: Geobacillus stearothermophilus-ը նախամշակվել է մեկ գիշերվա ընթացքում LB միջավայրում (200 rpm, 60°C) փորձարկումների յուրաքանչյուր օրից առաջ: 0,3-ից 0,5 օպտիկական խտությամբ (OD) G. stearothermophilus-ի կախույթի 5 մկլ կաթիլը դրվել է ոսկու նանոմասնիկներով ծածկույթի վրա: Այնուհետև 18 մմ տրամագծով կլոր կափարիչ, որի կենտրոնում 5 մմ տրամագծով անցք էր դրվել, կաթիլի վրա գցվել է, և նույն օպտիկական խտությամբ 5 մկլ բակտերիաների կախոցը բազմիցս կիրառվել է անցքի կենտրոնի վրա: Ծածկույթների վրա հորատանցքերը պատրաստվել են սույն հոդվածում նկարագրված ընթացակարգին համապատասխան: 45 (տե՛ս Լրացուցիչ տեղեկությունների համար): Այնուհետև ծածկույթի վրա ավելացրեք 1 մլ LB միջավայր, որպեսզի հեղուկ շերտը չչորանա: Վերջին ծածկույթը դրվում է Attofluor™ խցիկի փակ կափարիչի վրա՝ ինկուբացիայի ընթացքում միջավայրի գոլորշիացումը կանխելու համար: Բողբոջման փորձերի համար օգտագործեցինք սպորներ, որոնք սովորական փորձերից հետո երբեմն ծածկում էին վերին ծածկը։ Նմանատիպ մեթոդ կիրառվել է Sulfolobus shibatae ստանալու համար։ Երեք օր (200 rpm, 75°C) Thiobacillus serrata-ի նախնական մշակումն իրականացվել է 182 միջավայրում (DSMZ):
Ոսկու նանոմասնիկների նմուշները պատրաստվել են միցելյար բլոկային համապոլիմերային լիտոգրաֆիայի միջոցով։ Այս գործընթացը մանրամասն նկարագրված է Գլ. 60. Համառոտ, ոսկու իոնները պարփակող միցելները սինթեզվել են տոլուոլում համապոլիմերը HAuCl4-ի հետ խառնելով: Այնուհետև մաքրված ծածկույթները ընկղմվել են լուծույթի մեջ և մշակվել ուլտրամանուշակագույն ճառագայթմամբ՝ նվազեցնող նյութի առկայությամբ՝ ոսկու սերմեր ստանալու համար: Ի վերջո, ոսկու սերմերը աճեցվեցին՝ 16 րոպե KAuCl4-ի և էթանոլամինի ջրային լուծույթի հետ շփվելու միջոցով, ինչը հանգեցրեց ոսկու ոչ գնդաձև նանոմասնիկների գրեթե պարբերական և միատեսակ դասավորությանը մոտ ինֆրակարմիր հատվածում:
Ինտերֆերոգրամները OT պատկերների փոխարկելու համար մենք օգտագործեցինք տնական ալգորիթմ, ինչպես մանրամասնված է հղումում: 33 և հասանելի է որպես Matlab փաթեթ հետևյալ հանրային պահոցում՝ https://github.com/baffou/CGMprocess: Փաթեթը կարող է հաշվարկել ինտենսիվությունը և OT պատկերները՝ հիմնվելով գրանցված ինտերֆերոգրամների (ներառյալ տեղեկատու պատկերների) և տեսախցիկի զանգվածի հեռավորությունների վրա:
Տրված ջերմաստիճանի պրոֆիլ ստանալու համար SLM-ի վրա կիրառվող փուլային օրինաչափությունը հաշվարկելու համար մենք օգտագործեցինք նախկինում մշակված տնական ալգորիթմ39,42, որը հասանելի է հետևյալ հանրային պահոցում՝ https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping: Մուտքը ցանկալի ջերմաստիճանի դաշտն է, որը կարող է սահմանվել թվային կամ մոնոխրոմ bmp պատկերի միջոցով:
Բջիջները հատվածավորելու և դրանց չոր քաշը չափելու համար մենք օգտագործեցինք մեր Matlab ալգորիթմը, որը հրապարակվել է հետևյալ հանրային պահեստում՝ https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation: Յուրաքանչյուր պատկերի վրա օգտատերը պետք է սեղմի հետաքրքրող բակտերիաների կամ mCFU-ի վրա, կարգավորի գավազանի զգայունությունը և հաստատի ընտրությունը:
Ուսումնասիրության նախագծման մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս «Nature Research Report»-ի համառոտագիրը՝ կապված այս հոդվածի հետ:
Այս ուսումնասիրության արդյունքները հաստատող տվյալները հասանելի են համապատասխան հեղինակներից ողջամիտ պահանջով:
Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված սկզբնական կոդը մանրամասն ներկայացված է «Մեթոդներ» բաժնում, իսկ վրիպազերծման տարբերակները կարելի է ներբեռնել https://github.com/baffou/-ից հետևյալ պահոցներում՝ SLM_temperatureShaping, CGMprocess և CGM_magicWandSegmentation:
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles and their wide spectrum applications: Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight into thermophiles and their wide spectrum applications:Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK Թերմոֆիլների ակնարկ և դրանց լայն կիրառում: Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Մեհտա Ռ., Սինգհալ Պ., Սինգհ Հ., Դամլ Դ. և Շարմա Ա.Կ. Ջերմոֆիլների խորը պատկերացում և կիրառությունների լայն շրջանակ:3 Կենսատեխնոլոգիա 6, 81 (2016):
Հրապարակման ժամանակը՝ Sep-26-2022