Համապարփակ պրոտեոմիկան բացահայտում է ուղեղի վրա հիմնված ողնուղեղային հեղուկի կենսամարկերները ասիմպտոմատիկ և սիմպտոմատիկ Ալցհեյմերի հիվանդության դեպքում

Ալցհեյմերի հիվանդությանը (AD) բացակայում են սպիտակուցային բիոմարկերները, որոնք արտացոլում են դրա բազմաթիվ հիմքում ընկած պաթոֆիզիոլոգիան՝ խոչընդոտելով ախտորոշման և բուժման առաջընթացը: Այստեղ մենք օգտագործում ենք համապարփակ պրոտեոմիկա՝ ողնուղեղային հեղուկի (CSF) կենսամարկերները հայտնաբերելու համար, որոնք ներկայացնում են AD պաթոֆիզիոլոգիայի լայն շրջանակ: Մուլտիպլեքս զանգվածային սպեկտրոմետրիան բացահայտեց մոտավորապես 3500 և մոտավորապես 12000 սպիտակուցներ AD CSF-ում և ուղեղում, համապատասխանաբար: Ուղեղի պրոտեոմի ցանցային վերլուծությունը լուծեց կենսաբազմազանության 44 մոդուլ, որոնցից 15-ը համընկնում էին ողնուղեղային հեղուկի պրոտեոմի հետ: Այս համընկնող մոդուլներում CSF AD մարկերները ծալված են հինգ սպիտակուցային խմբերի, որոնք ներկայացնում են տարբեր պաթոֆիզիոլոգիական գործընթացներ: Սինապսները և մետաբոլիտները AD ուղեղում նվազում են, բայց CSF-ն ավելանում է, մինչդեռ ուղեղում և CSF-ում մեծանում են գլիալներով հարուստ միելինացիա և իմունային խմբերը: Վահանակի փոփոխությունների հետևողականությունը և հիվանդության առանձնահատկությունը հաստատվել են ՔՀՀ-ի ավելի քան 500 լրացուցիչ նմուշներում: Այս խմբերը նաև բացահայտեցին կենսաբանական ենթախմբերը ասիմպտոմատիկ AD-ում: Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները խոստումնալից քայլ են դեպի վեբ վրա հիմնված բիոմարկերային գործիքներ AD-ում կլինիկական կիրառությունների համար:
Ալցհեյմերի հիվանդությունը (ԱԱ) նեյրոդեգեներատիվ տկարամտության ամենատարածված պատճառն է ամբողջ աշխարհում և բնութագրվում է կենսաբանական համակարգի դիսֆունկցիայի լայն շրջանակով, ներառյալ սինապտիկ փոխանցումը, գլիալ միջնորդավորված իմունիտետը և միտոքոնդրիալ նյութափոխանակությունը (1-3): Այնուամենայնիվ, նրա հաստատված սպիտակուցային կենսամարկերները դեռ կենտրոնացած են ամիլոիդ և տաու սպիտակուցների հայտնաբերման վրա և, հետևաբար, չեն կարող արտացոլել այս բազմազան պաթոֆիզիոլոգիան: Այս «հիմնական» սպիտակուցային կենսամարկերները, որոնք առավել հուսալիորեն չափվում են ողնուղեղային հեղուկում (CSF) ներառում են (i) ամիլոիդ բետա պեպտիդ 1-42 (Aβ1-42), որն արտացոլում է կեղևային ամիլոիդային սալիկների ձևավորումը. (ii) ընդհանուր տաու, աքսոնի այլասերման նշան. (iii) ֆոսֆո-տաու (p-tau), պաթոլոգիական տաու հիպերֆոսֆորիլացման ներկայացուցիչ (4-7): Չնայած ողնուղեղային հեղուկի այս կենսամարկերները մեծապես նպաստել են AD-ի «նշված» սպիտակուցային հիվանդությունների հայտնաբերմանը (4-7), դրանք ներկայացնում են հիվանդության հետևում գտնվող բարդ կենսաբանության միայն մի փոքր մասը:
AD-ի կենսամարկերների պաթոֆիզիոլոգիական բազմազանության բացակայությունը հանգեցրել է բազմաթիվ մարտահրավերների, ներառյալ (i) AD հիվանդների կենսաբանական տարասեռությունը հայտնաբերելու և քանակականացնելու անկարողությունը, (ii) հիվանդության ծանրության և առաջընթացի անբավարար չափումը, հատկապես նախակլինիկական փուլում, և ( iii) թերապևտիկ դեղամիջոցների մշակում, որոնք չեն կարողացել ամբողջությամբ լուծել նյարդաբանական վատթարացման բոլոր ասպեկտները: Մեր կախվածությունը ուղենշային պաթոլոգիայի վրա՝ կապված հիվանդությունների AD-ն նկարագրելու համար, միայն խորացնում է այս խնդիրները: Ավելի ու ավելի շատ ապացույցներ ցույց են տալիս, որ տկարամտություն ունեցող տարեց մարդկանց մեծամասնությունն ունի ճանաչողական անկման մեկից ավելի պաթոլոգիական բնութագրիչ (8): AD-ի պաթոլոգիա ունեցող անհատների 90%-ը կամ ավելին ունեն նաև անոթային հիվանդություններ, TDP-43 ներառվածներ կամ այլ դեգեներատիվ հիվանդություններ (9): Պաթոլոգիական համընկնումների այս բարձր համամասնությունները խաթարել են դեմենցիայի մեր ներկայիս ախտորոշիչ շրջանակը, և անհրաժեշտ է հիվանդության ավելի համապարփակ պաթոֆիզիոլոգիական սահմանում:
Հաշվի առնելով AD-ի մի շարք կենսամարկերների հրատապ անհրաժեշտությունը, ոլորտն ավելի ու ավելի է ընդունում «omics» մեթոդը, որը հիմնված է բիոմարկերների հայտնաբերման ընդհանուր համակարգի վրա: Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance-ը մեկնարկել է 2014 թվականին և գտնվում է ծրագրի առաջնագծում: Առողջապահության, ակադեմիայի և արդյունաբերության ազգային ինստիտուտների այս բազմառարկայական ջանքերը նպատակ ունեն օգտագործել համակարգային ռազմավարություններ՝ AD-ի պաթոֆիզիոլոգիան ավելի լավ սահմանելու և կենսաբազմազանության ախտորոշման վերլուծության և բուժման ռազմավարություններ մշակելու համար (10): Որպես այս նախագծի մաս, ցանցային պրոտեոմիկան դարձել է խոստումնալից գործիք AD-ում համակարգի վրա հիմնված բիոմարկերների առաջխաղացման համար: Տվյալների վրա հիմնված այս անկողմնակալ մոտեցումը կազմակերպում է բարդ պրոտեոմիկայի տվյալների հավաքածուներ՝ համաարտահայտված սպիտակուցների խմբերի կամ «մոդուլների», որոնք կապված են հատուկ բջիջների տեսակների, օրգանելների և կենսաբանական գործառույթների հետ (11-13): Գրեթե 12 տեղեկատվական հարուստ ցանցային պրոտեոմիկայի ուսումնասիրություններ են իրականացվել AD ուղեղի վրա (13-23): Ընդհանուր առմամբ, այս վերլուծությունները ցույց են տալիս, որ AD ուղեղի ցանցի պրոտեոմը պահպանում է խիստ պահպանված մոդուլային կազմակերպություն անկախ խմբերում և բազմաթիվ կեղևային շրջաններում: Բացի այդ, այս մոդուլներից որոշները ցույց են տալիս տվյալների հավաքածուների մեջ AD-ի հետ կապված առատության վերարտադրելի փոփոխություններ՝ արտացոլելով բազմաթիվ հիվանդությունների պաթոֆիզիոլոգիան: Հավաքականորեն, այս բացահայտումները ցույց են տալիս խոստումնալից խարսխված կետ ուղեղի ցանցի պրոտեոմի հայտնաբերման համար՝ որպես համակարգի վրա հիմնված բիոմարկեր AD-ում:
AD ուղեղի ցանցի պրոտեոմը կլինիկականորեն օգտակար համակարգի վրա հիմնված բիոմարկերների փոխակերպելու համար մենք համատեղեցինք ուղեղից ստացված ցանցը AD CSF-ի պրոտեոմիկ վերլուծության հետ: Այս ինտեգրված մոտեցումը հանգեցրեց CSF-ի բիոմարկերների հինգ խոստումնալից խմբերի նույնականացմանը, որոնք կապված են ուղեղի վրա հիմնված պաթոֆիզիոլոգիայի լայն շրջանակի հետ, ներառյալ սինապսները, արյան անոթները, միելինացումը, բորբոքումը և նյութափոխանակության ուղիների դիսֆունկցիան: Մենք հաջողությամբ վավերացրել ենք այս բիոմարկերային վահանակները բազմակի վերարտադրման վերլուծությունների միջոցով, ներառյալ տարբեր նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների ավելի քան 500 CSF նմուշներ: Վավերացման այս վերլուծությունները ներառում են ասիմպտոմատիկ AD (AsymAD) ունեցող հիվանդների CSF-ի խմբային թիրախների ուսումնասիրությունը կամ նորմալ ճանաչողական միջավայրում ամիլոիդների աննորմալ կուտակման ապացույցների ցուցադրումը: Այս վերլուծությունները ընդգծում են զգալի կենսաբանական տարասեռությունը AsymAD-ի պոպուլյացիայի մեջ և բացահայտում են պանելային մարկերներ, որոնք կարող են ենթատիպել անհատներին հիվանդության ամենավաղ փուլերում: Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները ներկայացնում են առանցքային քայլ սպիտակուցային բիոմարկերային գործիքների մշակման գործում, որոնք հիմնված են բազմաթիվ համակարգերի վրա, որոնք կարող են հաջողությամբ լուծել AD-ի առջև ծառացած կլինիկական բազմաթիվ մարտահրավերներ:
Այս հետազոտության հիմնական նպատակն է բացահայտել ողնուղեղային հեղուկի նոր բիոմարկերները, որոնք արտացոլում են ուղեղի վրա հիմնված տարբեր պաթոֆիզիոլոգիա, որոնք հանգեցնում են AD-ի: Նկար S1-ը ուրվագծում է մեր հետազոտության մեթոդաբանությունը, որը ներառում է (i) համապարփակ վերլուծություն, որը հիմնված է AD CSF-ի և ցանցային ուղեղի պրոտեոմի նախնական բացահայտումներով՝ բացահայտելու ուղեղի հետ կապված ՔՀՀ հիվանդության բազմաթիվ բիոմարկերները, և (ii) հետագա վերարտադրությունը: հեղուկ խմբեր. Բացահայտման վրա հիմնված հետազոտությունը սկսվեց Էմորի Գոյզուետա Ալցհեյմերի հիվանդության հետազոտական ​​կենտրոնում (ADRC) 20 ճանաչողական նորմալ անհատների և 20 AD հիվանդների մոտ ՔՀՀ-ի դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծությամբ: AD-ի ախտորոշումը սահմանվում է որպես ճանաչողական զգալի խանգարում ցածր Aβ1-42-ի և ողնուղեղային հեղուկում ընդհանուր տաուի և p-tau-ի բարձր մակարդակի առկայության դեպքում [Միջին Մոնրեալի ճանաչողական գնահատում (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA): )]] (Աղյուսակ S1A): Վերահսկիչը (միջին ՄԿԱ, 26,7 ± 2,2) ուներ ՔՀՀ կենսամարկերների նորմալ մակարդակ:
Մարդու ՔՀՀ-ն բնութագրվում է սպիտակուցների առատության դինամիկ տիրույթով, որի դեպքում ալբումինը և այլ չափազանց առատ սպիտակուցները կարող են կանխել հետաքրքրող սպիտակուցների հայտնաբերումը (24): Սպիտակուցների հայտնաբերման խորությունը մեծացնելու համար մենք հեռացրել ենք առաջին 14 բարձր առատ սպիտակուցները ՔՀՀ յուրաքանչյուր նմուշից մինչև զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) վերլուծությունը (24): Ընդհանուր առմամբ 39805 պեպտիդ է հայտնաբերվել MS-ի կողմից, որոնք քարտեզագրվել են 3691 պրոտեոմներով 40 նմուշներում: Սպիտակուցների քանակականացումը կատարվում է բազմակի տանդեմ զանգվածային պիտակի (TMT) պիտակավորման միջոցով (18, 25): Բացակայող տվյալները լուծելու համար մենք ներառել ենք միայն այն սպիտակուցները, որոնք քանակականացվել են նմուշների առնվազն 50%-ում հետագա վերլուծության մեջ՝ այդպիսով վերջնականապես քանակականացնելով 2875 պրոտեոմ: Ընդհանուր սպիտակուցների առատության մակարդակների զգալի տարբերության պատճառով հսկիչ նմուշը վիճակագրորեն համարվել է արտաքուստ (13) և չի ներառվել հետագա վերլուծության մեջ: Մնացած 39 նմուշների առատության արժեքները ճշգրտվել են ըստ տարիքի, սեռի և խմբաքանակի կովարիանսի (13-15, 17, 18, 20, 26):
Օգտագործելով վիճակագրական t-թեստային վերլուծություն՝ ռեգրեսիայի տվյալների հավաքածուի վրա դիֆերենցիալ արտահայտությունը գնահատելու համար, այս վերլուծությունը հայտնաբերել է սպիտակուցներ, որոնց առատության մակարդակները զգալիորեն փոխվել են (P <0.05) վերահսկման և AD դեպքերի միջև (Աղյուսակ S2A): Ինչպես ցույց է տրված Նկար 1Ա-ում, AD-ում ընդհանուր 225 սպիտակուցների առատությունը զգալիորեն կրճատվել է, իսկ 303 սպիտակուցների առատությունը զգալիորեն աճել է: Այս դիֆերենցիալ արտահայտված սպիտակուցները ներառում են մի քանի նախկինում հայտնաբերված ողնուղեղային հեղուկի AD մարկերներ, ինչպիսիք են միկրոխողովակներով կապված սպիտակուցը tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), նեյրոֆիլամենտ (NEFL; P = 6,56 × 10−3), աճի հետ կապված սպիտակուց 43: (GAP43; P = 1,46 × 10−5), ճարպաթթու կապող սպիտակուց 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), քիտինազ 3 նման 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Նյարդային գրանուլին (NRGN; P = 3,43 × 10−4) և VGF նյարդի աճի գործոն (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6): Այնուամենայնիվ, մենք նաև հայտնաբերել ենք այլ շատ կարևոր թիրախներ, ինչպիսիք են ՀՆԱ-ի դիսոցացման արգելակիչը 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) և SPARC-ի հետ կապված մոդուլային կալցիումի կապակցումը 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9): 225 զգալիորեն կրճատված սպիտակուցների գենային գոյաբանության (GO) վերլուծությունը բացահայտեց սերտ կապեր մարմնում հեղուկի պրոցեսների հետ, ինչպիսիք են ստերոիդների նյութափոխանակությունը, արյան մակարդումը և հորմոնների ակտիվությունը (Նկար 1B և Աղյուսակ S2B): Ի հակադրություն, 303-ի զգալիորեն ավելացած սպիտակուցը սերտորեն կապված է բջիջների կառուցվածքի և էներգիայի նյութափոխանակության հետ:
(A) Հրաբխի գծապատկերը ցույց է տալիս log2 ծալովի փոփոխությունը (x-առանցք) համեմատ -log10 վիճակագրական P արժեքի (y-առանցքի) հետ, որը ստացվել է t-թեստով, որն օգտագործվում է հսկիչի (CT) և դիֆերենցիալ արտահայտությունը հայտնաբերելու համար: AD դեպքեր ՔՀՀ պրոտեոմի բոլոր սպիտակուցներից: Սպիտակուցները զգալիորեն նվազեցված մակարդակներով (P <0.05) AD-ում ցուցադրվում են կապույտով, մինչդեռ սպիտակուցները, որոնց մակարդակը զգալիորեն ավելացել է հիվանդության դեպքում, կարմիրով: Ընտրված սպիտակուցը պիտակավորված է: (B) Սպիտակուցի հետ կապված GO տերմինները զգալիորեն կրճատվել են (կապույտ) և ավելացել (կարմիր) AD-ում: Ցույց է տալիս GO երեք տերմինները ամենաբարձր z միավորներով կենսաբանական գործընթացների, մոլեկուլային ֆունկցիաների և բջջային բաղադրիչների ոլորտներում: (C) MS-ը չափեց MAPT մակարդակը CSF նմուշում (ձախ) և դրա հարաբերակցությունը նմուշի ELISA tau մակարդակի հետ (աջ): Ցուցադրվում է Pearson հարաբերակցության գործակիցը համապատասխան P արժեքի հետ: AD մեկ դեպքի համար ELISA տվյալների բացակայության պատճառով այս թվերը ներառում են արժեքներ 39 վերլուծված դեպքերից 38-ի համար: (D) Վերահսկվող կլաստերային վերլուծություն (P <0.0001, Բենջամինի-Հոչբերգ (BH) ճշգրտված P <0.01) հսկիչի և AD CSF-ի վրա հայտնաբերված նմուշներ՝ օգտագործելով տվյալների հավաքածուի 65 ամենազգալի փոփոխված սպիտակուցները: Ստանդարտացնել, նորմալացնել:
MAPT-ի պրոտեոմիկ մակարդակը սերտորեն կապված է ինքնուրույն չափված ELISA տաու մակարդակի հետ (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Նկար 1C), որն ապահովում է մեր MS չափման վավերությունը: Ամիլոիդ պրեկուրսոր սպիտակուցի (APP) մակարդակում տրիպսինի մարսումից հետո Aβ1-40-ի և Aβ1-42-ի C-վերնամասում քարտեզագրված իզոֆորմային հատուկ պեպտիդները չեն կարող արդյունավետ իոնացվել (27, 28): Հետևաբար, մեր հայտնաբերած APP պեպտիդները որևէ կապ չունեն ELISA Aβ1-42 մակարդակների հետ: Յուրաքանչյուր դեպքի դիֆերենցիալ արտահայտությունը գնահատելու համար մենք օգտագործեցինք դիֆերենցիալ արտահայտված սպիտակուցներ՝ P <0,0001 [կեղծ հայտնաբերման արագություն (FDR) ուղղված P <0,01]՝ նմուշների վերահսկվող կլաստերային վերլուծություն կատարելու համար (Աղյուսակ S2A): Ինչպես ցույց է տրված Գծապատկեր 1D-ում, այս 65 խիստ նշանակալի սպիտակուցները կարող են ճիշտ հավաքել նմուշները՝ ըստ հիվանդության վիճակի, բացառությամբ վերահսկման նման բնութագրերով մեկ դեպքի: Այս 65 սպիտակուցներից 63-ն ավելացել է AD-ում, մինչդեռ միայն երկուսը (CD74 և ISLR) նվազել են: Ընդհանուր առմամբ, ողնուղեղային հեղուկի այս անալիզները AD-ում հայտնաբերել են հարյուրավոր սպիտակուցներ, որոնք կարող են ծառայել որպես հիվանդության բիոմարկերներ:
Այնուհետև մենք կատարեցինք AD ուղեղի պրոտեոմի անկախ ցանցային վերլուծություն: Այս հայտնագործության ուղեղի խումբը ներառում էր թիկունքային նախաճակատային ծառի կեղևը (DLPFC) հսկողության (n = 10), Պարկինսոնի հիվանդության (PD; n = 10), խառը AD/PD (n = 10) և AD (n = 10) դեպքերից: ) Նմուշ. Emery Goizueta ADRC. Այս 40 դեպքերի ժողովրդագրական տվյալները նախկինում նկարագրված են (25) և ամփոփված են Աղյուսակ S1B-ում: Մենք օգտագործել ենք TMT-MS՝ վերլուծելու այս 40 ուղեղի հյուսվածքները և 27 դեպքերի կրկնօրինակման խումբը: Ընդհանուր առմամբ, ուղեղի այս երկու տվյալների հավաքածուները արտադրել են 227,121 եզակի պեպտիդներ, որոնք քարտեզագրվել են 12,943 պրոտեոմների (25): Միայն այն սպիտակուցները, որոնք քանակապես որոշվել են դեպքերի առնվազն 50%-ում, ներառվել են հետագա հետազոտություններում: Վերջնական հայտնաբերման տվյալների հավաքածուն պարունակում է 8817 քանակական սպիտակուցներ: Կարգավորել սպիտակուցների առատության մակարդակը՝ հիմնվելով տարիքի, սեռի և հետմահու միջակայքի վրա (PMI): Ռեգրեսիայից հետո տվյալների հավաքածուի դիֆերենցիալ էքսպրեսիայի վերլուծությունը ցույց տվեց, որ ավելի քան 2000 սպիտակուցի մակարդակը զգալիորեն փոխվել է [P <0.05, շեղումների վերլուծություն (ANOVA)] երկու կամ ավելի հիվանդությունների խմբերում: Այնուհետև մենք կատարեցինք վերահսկվող կլաստերային վերլուծություն՝ հիմնված դիֆերենցիալ արտահայտված սպիտակուցների և P <0,0001 AD/վերահսկողության և/կամ AD/PD համեմատությունների վրա (Նկար S2, A և B, Աղյուսակ S2C): Այս 165 խիստ փոփոխված սպիտակուցները հստակ պատկերում են AD պաթոլոգիայի դեպքերը հսկողության և PD նմուշներից՝ հաստատելով AD-ի հատուկ փոփոխություններն ամբողջ պրոտեոմում:
Այնուհետև մենք օգտագործեցինք ալգորիթմ, որը կոչվում է Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA)՝ հայտնաբերված ուղեղի պրոտեոմի վրա ցանցային վերլուծություն կատարելու համար, որը տվյալների հավաքածուն կազմակերպում է սպիտակուցային մոդուլների մեջ՝ արտահայտման նմանատիպ ձևերով (11-13): Վերլուծության արդյունքում հայտնաբերվել են 44 մոդուլներ (M) համաարտահայտված սպիտակուցներ՝ տեսակավորված և համարակալված ամենամեծից (M1, n = 1821 սպիտակուցներ) մինչև ամենափոքրը (M44, n = 34 սպիտակուցներ) (Նկար 2A և Աղյուսակ S2D) ): Ինչպես նշվեց վերևում (13) Հաշվեք յուրաքանչյուր մոդուլի ներկայացուցչական արտահայտման պրոֆիլը կամ բնորոշ սպիտակուցը և կապեք այն հիվանդության վիճակի և AD պաթոլոգիայի հետ, այսինքն՝ հաստատեք Ալցհեյմերի հիվանդությունների ռեգիստրի (CERAD) և Braak Score-ի դաշինքը (Նկար 2B): Ընդհանուր առմամբ, 17 մոդուլներ էականորեն կապված էին AD նյարդաբանության հետ (P <0.05): Հիվանդության հետ կապված այս մոդուլներից շատերը հարուստ են նաև բջիջների տեսակի հատուկ մարկերներով (Նկար 2B): Ինչպես նշվեց վերևում (13), բջիջների տիպի հարստացումը որոշվում է՝ վերլուծելով մոդուլի համընկնումը և բջիջների տիպին հատուկ գեների հղումների ցանկը: Այս գեները ստացվել են մկան մեկուսացված նեյրոնների, էնդոթելային և գլիալ բջիջների հրապարակված տվյալների հիման վրա: ՌՆԹ-ի հաջորդականության (RNA-seq) փորձ (29).
(Ա) Բացահայտեք ուղեղի պրոտեոմի WGCNA-ն: (B) Մոդուլային ստորագրության սպիտակուցի երկքաշային միջանկյալ հարաբերակցության (BiCor) վերլուծություն (մոդուլային սպիտակուցի արտահայտման առաջին հիմնական բաղադրիչը) AD նյարդապաթոլոգիական բնութագրերով (վերևում), ներառյալ CERAD (Aβ ափսե) և Braak (tau tangles) միավորները: Դրական (կարմիր) և բացասական (կապույտ) հարաբերակցությունների ինտենսիվությունը ցուցադրվում է երկգույն ջերմային քարտեզով, իսկ աստղանիշները ցույց են տալիս վիճակագրական նշանակություն (P <0.05): Օգտագործեք Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (ներքև) յուրաքանչյուր սպիտակուցային մոդուլի բջիջների տիպի կապը գնահատելու համար: Կարմիր ստվերի ինտենսիվությունը ցույց է տալիս բջիջների տիպի հարստացման աստիճանը, իսկ աստղանիշը ցույց է տալիս վիճակագրական նշանակություն (P <0,05): FET-ից ստացված P արժեքը շտկելու համար օգտագործեք BH մեթոդը: (C) մոդուլային սպիտակուցների GO վերլուծություն: Յուրաքանչյուր մոդուլի կամ հարակից մոդուլների խմբի համար ցուցադրվում են առավել սերտորեն կապված կենսաբանական գործընթացները: օլիգո, օլիգոդենդրոցիտ:
Հինգ սերտորեն կապված աստղասիտներով և միկրոգլիաներով հարուստ մոդուլներից բաղկացած մի շարք (M30, M29, M18, M24 և M5) ցույց տվեցին ուժեղ դրական հարաբերակցություն AD նյարդաբանության հետ (Նկար 2B): Գոյաբանական վերլուծությունը կապում է այս գլիալ մոդուլները բջիջների աճի, տարածման և իմունիտետի հետ (Նկար 2C և Աղյուսակ S2E): Երկու լրացուցիչ գլիալ մոդուլներ՝ M8 և M22, նույնպես խիստ վերկարգավորված են հիվանդության դեպքում: M8-ը մեծապես կապված է Toll-ի նման ընկալիչի ուղու հետ՝ ազդանշանային կասկադ, որը առանցքային դեր է խաղում բնածին իմունային պատասխանում (30): Միևնույն ժամանակ, M22-ը սերտորեն կապված է հետթարգմանական փոփոխության հետ: M2-ը, որը հարուստ է օլիգոդենդրոցիտներով, ցույց է տալիս ուժեղ դրական փոխկապակցվածություն AD-ի պաթոլոգիայի հետ և գոյաբանական կապ նուկլեոզիդների սինթեզի և ԴՆԹ-ի վերարտադրության հետ, ինչը ցույց է տալիս հիվանդությունների ժամանակ բջիջների ավելացված բազմացումը: Ընդհանուր առմամբ, այս բացահայտումները աջակցում են գլիալ մոդուլների բարձրացմանը, որոնք մենք նախկինում դիտարկել ենք AD ցանցի պրոտեոմում (13, 17): Ներկայումս պարզվում է, որ ցանցում շատ AD-ի հետ կապված գլիալ մոդուլներ ցույց են տալիս ավելի ցածր արտահայտվածության մակարդակ վերահսկման և PD դեպքերում՝ ընդգծելով դրանց հիվանդության առանձնահատկությունը, որը բարձրացված է AD-ում (Նկար S2C):
Մեր ցանցի պրոտեոմի միայն չորս մոդուլներ (M1, M3, M10 և M32) խիստ բացասաբար են փոխկապակցված AD պաթոլոգիայի հետ (P <0.05) (Նկար 2, B և C): Ե՛վ M1, և՛ M3-ը հարուստ են նեյրոնային մարկերներով: M1-ը մեծապես կապված է սինապտիկ ազդանշանների հետ, մինչդեռ M3-ը սերտորեն կապված է միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի հետ։ M10-ի և M32-ի բջիջների տիպի հարստացման ապացույցներ չկան: M32-ն արտացոլում է M3-ի և բջջային նյութափոխանակության միջև կապը, մինչդեռ M10-ը մեծապես կապված է բջիջների աճի և միկրոխողովակների ֆունկցիայի հետ: Համեմատած AD-ի հետ՝ բոլոր չորս մոդուլներն ավելացել են վերահսկման և PD-ի մեջ՝ տալով նրանց հիվանդության հատուկ AD փոփոխություններ (Նկար S2C): Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները աջակցում են նեյրոններով հարուստ մոդուլների նվազման առատությանը, որոնք մենք նախկինում դիտարկել ենք AD-ում (13, 17): Ամփոփելով, ուղեղի պրոտեոմի ցանցային վերլուծությունը, որը մենք հայտնաբերեցինք, արտադրեց AD-ի հատուկ փոփոխված մոդուլներ, որոնք համահունչ են մեր նախորդ բացահայտումներին:
AD-ն բնութագրվում է վաղ ասիմպտոմատիկ փուլով (AsymAD), որտեղ անհատները ցուցադրում են ամիլոիդի կուտակում առանց կլինիկական կոգնիտիվ անկման (5, 31): Այս ասիմպտոմատիկ փուլը կրիտիկական պատուհան է վաղ հայտնաբերման և միջամտության համար: Մենք նախկինում ցուցադրել ենք AsymAD-ի և AD ուղեղի ցանցի պրոտեոմի ուժեղ մոդուլային պահպանումը անկախ տվյալների հավաքածուներում (13, 17): Որպեսզի համոզվենք, որ ներկայումս հայտնաբերված ուղեղի ցանցը համապատասխանում է այս նախորդ բացահայտումներին, մենք վերլուծեցինք 44 մոդուլների պահպանումը 27 DLPFC կազմակերպությունների կրկնօրինակված տվյալների հավաքածուում: Այս կազմակերպությունները ներառում են վերահսկողություն (n = 10), AsymAD (n = 8 ) և AD (n = 9) դեպքեր: Վերահսկիչ և AD նմուշները ներառվել են մեր հայտնաբերման ուղեղի խմբի վերլուծության մեջ (Աղյուսակ S1B), մինչդեռ AsymAD-ի դեպքերը եզակի էին միայն կրկնօրինակման կոհորտում: AsymAD-ի այս դեպքերը նույնպես եկել են Emory Goizueta ADRC ուղեղի բանկից: Չնայած մահվան պահին իմացությունը նորմալ էր, ամիլոիդի մակարդակը աննորմալ բարձր էր (միջին CERAD, 2,8 ± 0,5) (Աղյուսակ S1B):
Այս 27 ուղեղի հյուսվածքների TMT-MS վերլուծությունը հանգեցրեց 11244 պրոտեոմի քանակականացմանը: Այս վերջնական հաշվարկը ներառում է միայն այն սպիտակուցները, որոնք քանակականորեն հաշվառված են նմուշների առնվազն 50%-ում: Այս կրկնօրինակված տվյալների հավաքածուն պարունակում է 8638 (98.0%) 8817 սպիտակուցներից, որոնք հայտնաբերվել են մեր հայտնագործության ուղեղի վերլուծության ժամանակ, և ունի մոտ 3000 զգալիորեն փոխված սպիտակուցներ վերահսկման և AD խմբերի միջև (P <0.05, Տուկիի զուգակցված t թեստից հետո՝ շեղումների վերլուծության համար) ( Աղյուսակ S2F): Այս դիֆերենցիալ արտահայտված սպիտակուցներից 910-ը նաև ցույց տվեց մակարդակի զգալի փոփոխություններ AD-ի և ուղեղի պրոտեոմի վերահսկման դեպքերի միջև (P <0.05, ANOVA Tukey զույգ t-թեստից հետո): Հարկ է նշել, որ այս 910 մարկերները խիստ հետևողական են պրոտեոմների միջև փոփոխության ուղղությամբ (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Նկար S3A): Ավելացված սպիտակուցների շարքում տվյալների հավաքածուների միջև առավել հետևողական փոփոխություններով սպիտակուցները հիմնականում գլիալով հարուստ M5 և M18 մոդուլների անդամներ են (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 և GFAP): Կրճատված սպիտակուցների շարքում առավել հետևողական փոփոխություններ ունեցողները գրեթե բացառապես M1 մոդուլի անդամներ էին (NPTX2, VGF և RPH3A), որոնք կապված են սինապսի հետ: Մենք լրացուցիչ ստուգեցինք AD-ի հետ կապված փոփոխությունները midkine-ի (MDK), CD44-ի, սեկրեցված փխրուն սպիտակուցի 1-ի (SFRP1) և VGF-ի հետ կապված փոփոխությունները western blotting-ով (Նկար S3B): Մոդուլի պահպանման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ ուղեղի պրոտեոմում գտնվող սպիտակուցային մոդուլների մոտ 80%-ը (34/44) զգալիորեն պահպանվել է վերարտադրման տվյալների հավաքածուում (z-score> 1.96, FDR ուղղված P <0.05) (Նկար S3C): Այս մոդուլներից 14-ը հատուկ վերապահված էին երկու պրոտեոմների միջև (z-score> 10, FDR-ի ուղղումը P <1,0 × 10−23): Ընդհանուր առմամբ, ուղեղի պրոտեոմի միջև դիֆերենցիալ արտահայտման և մոդուլային կազմի հետևողականության բարձր աստիճանի հայտնաբերումը և կրկնօրինակումը կարևորում է AD ճակատային կեղևի սպիտակուցների փոփոխությունների վերարտադրելիությունը: Բացի այդ, այն նաև հաստատեց, որ AsymAD-ը և ավելի առաջադեմ հիվանդությունները ունեն ուղեղի ցանցի շատ նման կառուցվածք:
Ուղեղի վերարտադրության տվյալների հավաքածուի դիֆերենցիալ արտահայտման ավելի մանրամասն վերլուծությունը ընդգծում է AsymAD սպիտակուցի փոփոխությունների զգալի աստիճանը, ներառյալ ընդհանուր առմամբ 151 զգալիորեն փոխված սպիտակուցներ AsymAD-ի և հսկողության միջև (P <0.05) (Նկար S3D): Համապատասխան ամիլոիդային բեռի հետ՝ AsymAD-ի և AD-ի ուղեղում APP-ն զգալիորեն աճել է: MAPT-ը զգալիորեն փոխվում է միայն AD-ում, ինչը համահունչ է խճճվածության մակարդակի բարձրացմանը և նրա հայտնի հարաբերակցությանը ճանաչողական անկման հետ (5, 7): Գլիալով հարուստ մոդուլները (M5 և M18) մեծապես արտացոլվում են AsymAD-ում ավելացված սպիտակուցների մեջ, մինչդեռ նեյրոնների հետ կապված M1 մոդուլը AsymAD-ի նվազած սպիտակուցների ամենաներկայացուցիչն է: Այս AsymAD մարկերներից շատերը ցույց են տալիս սիմպտոմատիկ հիվանդությունների ավելի մեծ փոփոխություններ: Այս մարկերների թվում է SMOC1-ը՝ M18-ին պատկանող գլիալ սպիտակուցը, որը կապված է ուղեղի ուռուցքների և աչքերի և վերջույթների զարգացման հետ (32): MDK-ն հեպարին կապող աճի գործոն է, որը կապված է բջիջների աճի և անգիոգենեզի հետ (33), M18-ի մեկ այլ անդամ: Վերահսկիչ խմբի համեմատ AsymAD-ը զգալիորեն աճել է, որին հաջորդել է AD-ի ավելի մեծ աճ: Ի հակադրություն, սինապտիկ սպիտակուցը նեյրոպենտրաքսին 2 (NPTX2) զգալիորեն կրճատվել է AsymAD ուղեղում: NPTX2-ը նախկինում կապված էր նեյրոդեգեներացիայի հետ և ճանաչված դեր ունի գրգռիչ սինապսների միջնորդության գործում (34): Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները բացահայտում են AD-ի տարբեր նախակլինիկական սպիտակուցային փոփոխություններ, որոնք կարծես թե զարգանում են հիվանդության ծանրության հետ:
Հաշվի առնելով, որ ուղեղի պրոտեոմի հայտնաբերման ժամանակ մենք հասել ենք սպիտակուցային ծածկույթի զգալի խորության, մենք փորձում ենք ավելի լիարժեք հասկանալ դրա համընկնումը ցանցային մակարդակի AD տրանսկրիպտոմի հետ: Հետևաբար, մենք համեմատեցինք մեր հայտնաբերած ուղեղի պրոտեոմը մոդուլի հետ, որը նախկինում ստեղծվել էր AD (n = 308) և հսկիչ (n = 157) DLPFC հյուսվածքներում 18204 գեների միկրոզանգվածի չափումից (13): համընկնող. Ընդհանուր առմամբ, մենք հայտնաբերեցինք 20 տարբեր ՌՆԹ մոդուլներ, որոնցից շատերը ցույց տվեցին բջիջների հատուկ տեսակների հարստացումը, ներառյալ նեյրոնները, օլիգոդենդրոցիտները, աստղոցիտները և միկրոգլիաները (Նկար 3Ա): Այս մոդուլների բազմակի փոփոխությունները AD-ում ներկայացված են Նկար 3B-ում: Համահունչ մեր նախորդ սպիտակուցի-ՌՆԹ-ի համընկնման վերլուծությանը՝ օգտագործելով ավելի խորը չպիտակավորված MS պրոտեոմը (մոտ 3000 սպիտակուց) (13), ուղեղի պրոտեոմային ցանցի 44 մոդուլների մեծ մասը, որոնք մենք գտել ենք, գտնվում են տրանսկրիպտոմային ցանցում։ Չկա էական համընկնումը։ 34 սպիտակուցային մոդուլների մեր հայտնաբերումն ու կրկնօրինակումը, որոնք մեծապես պահպանվում են ուղեղի պրոտեոմում, միայն 14-ն են (~40%) անցել Ֆիշերի ճշգրիտ թեստը (FET), որը վիճակագրորեն նշանակալի համընկնում է տրանսկրիպտոմի հետ (Նկար 3Ա): Համատեղելի է ԴՆԹ-ի վնասների վերականգնման (P-M25 և P-M19), սպիտակուցների թարգմանության (P-M7 և P-M20), ՌՆԹ-ի կապակցման/սպլիզավորման (P-M16 և P-M21) և սպիտակուցների թիրախավորման (P-M13 և P-) հետ: M23) չի համընկնում տրանսկրիպտոմի մոդուլների հետ: Հետևաբար, թեև ընթացիկ համընկնման վերլուծության մեջ օգտագործվում է ավելի խորը պրոտեոմային տվյալների հավաքածու (13), AD ցանցի պրոտեոմի մեծ մասը քարտեզագրված չէ տրանսկրիպտոմային ցանցին:
(A) Հիպերերկրաչափական FET-ը ցույց է տալիս բջիջների տիպային հատուկ մարկերների հարստացումը AD տրանսկրիպտոմի ՌՆԹ մոդուլում (վերևում) և AD ուղեղի ՌՆԹ (x-առանցք) և սպիտակուցային (y-առանցք) մոդուլների միջև համընկնման աստիճանը: (ներքևում): Կարմիր ստվերի ինտենսիվությունը ցույց է տալիս վերին վահանակի բջիջների տեսակների հարստացման աստիճանը և ներքևի վահանակում մոդուլների համընկնման ինտենսիվությունը: Աստղանիշները ցույց են տալիս վիճակագրական նշանակություն (P <0,05): (B) Յուրաքանչյուր տրանսկրիպտոմային մոդուլի բնորոշ գեների և AD կարգավիճակի միջև հարաբերակցության աստիճանը: Ձախ կողմում գտնվող մոդուլները ամենից բացասաբար են փոխկապակցված AD-ի հետ (կապույտ), իսկ աջ կողմում գտնվող մոդուլները ամենադրականը փոխկապակցված են AD-ի հետ (կարմիր): Լոգանափոխված BH-ով ուղղված P արժեքը ցույց է տալիս յուրաքանչյուր հարաբերակցության վիճակագրական նշանակության աստիճանը: (C) Զգալի համընկնող մոդուլներ՝ ընդհանուր բջջային տեսակի հարստացմամբ: (D) պիտակավորված սպիտակուցի (x-առանցք) և ՌՆԹ (y-առանցք) log2-ապատիկի փոփոխության փոխկապակցված վերլուծություն համընկնող մոդուլում: Ցուցադրվում է Pearson հարաբերակցության գործակիցը համապատասխան P արժեքի հետ: Միկրո, միկրոգլիա; երկնային մարմիններ, աստրոցիտներ: CT, հսկողություն.
Սպիտակուցի և ՌՆԹ-ի համընկնող մոդուլների մեծ մասը կիսում են բջիջների տիպի հարստացման նմանատիպ պրոֆիլները և AD փոփոխության հետևողական ուղղությունները (Նկար 3, B և C): Այլ կերպ ասած, ուղեղի պրոտեոմի սինապսի հետ կապված M1 մոդուլը (PM​1) քարտեզագրված է երեք նեյրոններով հարուստ հոմոլոգ ՌՆԹ մոդուլների (R-M1, R-M9 և R-M16), որոնք գտնվում են AD-ում։ իջեցված մակարդակ: Նմանապես, գլիալով հարուստ M5 և M18 սպիտակուցային մոդուլները համընկնում են ՌՆԹ մոդուլների հետ, որոնք հարուստ են աստրոցիտներով և միկրոգլիալ մարկերներով (R-M3, R-M7 և R-M10) և մեծապես մասնակցում են հիվանդությունների աճին: Այս ընդհանուր մոդուլային առանձնահատկությունները երկու տվյալների հավաքածուների միջև հետագայում աջակցում են բջիջների տիպի հարստացմանը և հիվանդության հետ կապված փոփոխություններին, որոնք մենք դիտել ենք ուղեղի պրոտեոմում: Այնուամենայնիվ, մենք նկատեցինք շատ էական տարբերություններ այս ընդհանուր մոդուլներում առանձին մարկերների ՌՆԹ-ի և սպիտակուցի մակարդակների միջև: Այս համընկնող մոդուլների ներսում մոլեկուլների պրոտեոմիկայի և տրանսկրիպտոմիկայի դիֆերենցիալ արտահայտման հարաբերակցության վերլուծությունը (Նկար 3D) ընդգծում է այս անհամապատասխանությունը: Օրինակ, APP-ն և մի քանի այլ գլիալ մոդուլի սպիտակուցներ (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 և SFRP1) ցույց են տվել AD պրոտեոմի զգալի աճ, բայց AD տրանսկրիպտոմում գրեթե փոփոխություն չի եղել: Սպիտակուցին հատուկ այս փոփոխությունները կարող են սերտորեն կապված լինել ամիլոիդային սալիկների հետ (23, 35)՝ ընդգծելով պրոտեոմը որպես պաթոլոգիական փոփոխությունների աղբյուր, և այդ փոփոխությունները կարող են չարտացոլվել տրանսկրիպտոմում:
Մեր հայտնաբերած ուղեղի և CSF-ի պրոտեոմների անկախ վերլուծությունից հետո մենք իրականացրեցինք տվյալների երկու հավաքածուների համապարփակ վերլուծություն՝ բացահայտելու AD CSF բիոմարկերները՝ կապված ուղեղի ցանցի պաթոֆիզիոլոգիայի հետ: Մենք նախ պետք է սահմանենք երկու պրոտեոմների համընկնումը: Թեև լայնորեն ընդունված է, որ ՔՀՀ-ն արտացոլում է նյարդաքիմիական փոփոխությունները AD ուղեղում (4), AD ուղեղի և CSF պրոտեոմի միջև համընկնման ճշգրիտ աստիճանը պարզ չէ: Համեմատելով մեր երկու պրոտեոմներում հայտնաբերված ընդհանուր գենային արտադրատեսակների քանակը՝ մենք պարզեցինք, որ ողնուղեղային հեղուկում հայտնաբերված սպիտակուցների գրեթե 70%-ը (n = 1936) նույնպես քանակականացվել է ուղեղում (Նկար 4Ա): Այս համընկնող սպիտակուցների մեծ մասը (n = 1721) քարտեզագրված է հայտնաբերման ուղեղի տվյալների հավաքածուի 44 համակարտահայտման մոդուլներից մեկին (Նկար 4B): Ինչպես և սպասվում էր, ուղեղի վեց ամենամեծ մոդուլները (M1-ից M6) ցուցադրեցին CSF-ի համընկնման ամենամեծ քանակությունը: Այնուամենայնիվ, կան ուղեղի ավելի փոքր մոդուլներ (օրինակ, M15 և M29), որոնք հասնում են անսպասելիորեն բարձր համընկնման աստիճանի, որն ավելի մեծ է, քան ուղեղի մոդուլը իր չափից երկու անգամ: Սա մեզ դրդում է որդեգրել ավելի մանրամասն, վիճակագրորեն հիմնված մեթոդ՝ հաշվարկելու ուղեղի և ողնուղեղային հեղուկի համընկնումը:
(A և B) հայտնաբերված ուղեղի և CSF տվյալների հավաքածուներում հայտնաբերված սպիտակուցները համընկնում են: Այս համընկնող սպիտակուցների մեծ մասը կապված է ուղեղի համաարտահայտման ցանցի 44 համաարտահայտման մոդուլներից մեկի հետ: (C) Բացահայտեք գլխուղեղի հեղուկի պրոտեոմի և ուղեղի ցանցի պրոտեոմի համընկնումը: Ջերմային քարտեզի յուրաքանչյուր տող ներկայացնում է հիպերերկրաչափական FET-ի առանձին համընկնման վերլուծություն: Վերևի շարքը պատկերում է ուղեղի մոդուլի և CSF ամբողջ պրոտեոմի միջև համընկնումը (մոխրագույն/սև ստվերում): Երկրորդ տողը պատկերում է, որ ուղեղի մոդուլների և CSF սպիտակուցի (կարմիրով ստվերված) համընկնումը զգալիորեն կարգավորվում է AD-ում (P <0.05): Երրորդ շարքը ցույց է տալիս, որ ուղեղի մոդուլների և CSF սպիտակուցի միջև համընկնումը (կապույտ ստվերում) զգալիորեն ցածր է կարգավորվում AD-ում (P <0.05): FET-ից ստացված P արժեքը շտկելու համար օգտագործեք BH մեթոդը: (D) Ծալովի մոդուլի վահանակ՝ հիմնված բջջային տիպի ասոցիացիայի և հարակից GO տերմինների վրա: Այս վահանակները պարունակում են ընդհանուր առմամբ 271 ուղեղի հետ կապված սպիտակուցներ, որոնք ունեն զգալի դիֆերենցիալ արտահայտություն ՔՀՀ պրոտեոմում:
Օգտագործելով միակողմանի FET-ներ, մենք գնահատեցինք սպիտակուցի համընկնման կարևորությունը ՔՀՀ պրոտեոմի և ուղեղի առանձին մոդուլների միջև: Վերլուծությունը ցույց տվեց, որ ընդհանուր 14 ուղեղի մոդուլները CSF տվյալների հավաքածուում ունեն վիճակագրորեն նշանակալի համընկնումներ (FDR ճշգրտված P <0.05), և լրացուցիչ մոդուլ (M18), որի համընկնումը մոտ է նշանակալիությանը (FDR ճշգրտված P = 0.06) (Նկար 4C): , վերին տող): Մենք նաև հետաքրքրված ենք մոդուլներով, որոնք խիստ համընկնում են ՔՀՀ-ի տարբեր արտահայտված սպիտակուցների հետ: Հետևաբար, մենք կիրառեցինք երկու լրացուցիչ FET անալիզ՝ որոշելու համար, թե (i) CSF սպիտակուցը զգալիորեն ավելացել է AD-ում և (ii) CSF սպիտակուցը զգալիորեն նվազել է AD-ում (P <0.05, զուգակցված t թեստ AD/վերահսկողություն) Ուղեղի մոդուլները՝ իմաստալից համընկնմամբ: նրանց միջև։ Ինչպես ցույց է տրված Նկար 4C-ի միջին և ստորին շարքերում, այս լրացուցիչ վերլուծությունները ցույց են տալիս, որ ուղեղի 44 մոդուլներից 8-ը զգալիորեն համընկնում են AD CSF-ում ավելացված սպիտակուցի հետ (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 և M38): . ), մինչդեռ միայն երկու մոդուլներ (M6 և M15) ցույց տվեցին նշանակալի համընկնումը AD CSF-ում նվազեցված սպիտակուցի հետ: Ինչպես և սպասվում էր, բոլոր 10 մոդուլները գտնվում են 15 մոդուլներում, որոնք ամենաբարձր համընկնումը ունեն CSF պրոտեոմի հետ: Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ այս 15 մոդուլները AD ուղեղից ստացված CSF կենսամարկերների բարձր եկամտաբեր աղբյուրներ են:
Մենք ծալեցինք այս 15 համընկնող մոդուլները հինգ մեծ սպիտակուցային վահանակների մեջ՝ հիմնվելով WGCNA ծառի գծապատկերում դրանց մոտիկության և բջիջների տեսակների և գենային գոյաբանության հետ կապի վրա (Նկար 4D): Առաջին վահանակը պարունակում է մոդուլներ, որոնք հարուստ են նեյրոնային մարկերներով և սինապսի հետ կապված սպիտակուցներով (M1 և M12): Սինապտիկ վահանակը պարունակում է ընդհանուր առմամբ 94 սպիտակուց, և CSF-ի պրոտեոմի մակարդակները զգալիորեն փոխվել են, ինչը այն դարձնում է ուղեղի հետ կապված CSF մարկերների ամենամեծ աղբյուրը հինգ վահանակների մեջ: Երկրորդ խումբը (M6 և M15) ցույց տվեց սերտ կապ էնդոթելային բջիջների մարկերների և անոթային մարմնի հետ, ինչպիսիք են «վերքերի բուժումը» (M6) և «հումորալ իմունային պատասխանի կարգավորումը» (M15): M15-ը նաև մեծապես կապված է լիպոպրոտեինների նյութափոխանակության հետ, որը սերտորեն կապված է էնդոթելիի հետ (36): Անոթային վահանակը պարունակում է ուղեղի հետ կապված 34 CSF մարկեր: Երրորդ խումբը ներառում է մոդուլներ (M2 և M4), որոնք զգալիորեն կապված են օլիգոդենդրոցիտների մարկերների և բջիջների բազմացման հետ: Օրինակ, M2-ի վերին մակարդակի գոյաբանության տերմինները ներառում են «ԴՆԹ-ի վերարտադրության դրական կարգավորումը» և «պուրինի կենսասինթեզի գործընթացը»: Մինչդեռ, M4-ը ներառում է «գլիալ բջիջների տարբերակում» և «քրոմոսոմների տարանջատում»: Myelination վահանակը պարունակում է 49 CSF մարկեր, որոնք կապված են ուղեղի հետ:
Չորրորդ խումբը պարունակում է ամենաշատ մոդուլները (M30, M29, M18, M24 և M5), և գրեթե բոլոր մոդուլները զգալիորեն հարուստ են միկրոգլիաներով և աստղոցիտային մարկերներով: Միելինացման վահանակի նման, չորրորդ վահանակը պարունակում է նաև մոդուլներ (M30, M29 և M18), որոնք սերտորեն կապված են բջիջների տարածման հետ: Այս խմբի մյուս մոդուլները մեծապես կապված են իմունոլոգիական տերմինների հետ, ինչպիսիք են «իմունային ազդեցության գործընթացը» (M5) և «իմունային պատասխանի կարգավորումը» (M24): Գլիալ իմունային խումբը պարունակում է ուղեղի հետ կապված 42 CSF մարկեր: Վերջապես, վերջին վահանակը ներառում է ուղեղի հետ կապված 52 մարկեր չորս մոդուլների վրա (M44, M3, M33 և M38), որոնք բոլորն էլ մարմնի վրա են՝ կապված էներգիայի պահպանման և նյութափոխանակության հետ: Այս մոդուլներից ամենամեծը (M3) սերտորեն կապված է միտոքոնդրիաների հետ և հարուստ է նեյրոնային հատուկ մարկերներով։ M38-ը այս մետաբոլոմի փոքր մոդուլի անդամներից մեկն է և նաև ցուցաբերում է չափավոր նեյրոնային առանձնահատկություն:
Ընդհանուր առմամբ, այս հինգ վահանակները արտացոլում են բջիջների տեսակների և գործառույթների լայն շրջանակ AD ծառի կեղևում և միասին պարունակում են 271 ուղեղի հետ կապված CSF մարկեր (Աղյուսակ S2G): Այս MS արդյունքների վավերականությունը գնահատելու համար մենք օգտագործեցինք հարևանության երկարացման վերլուծությունը (PEA), հակամարմինների վրա հիմնված ուղղանկյուն տեխնոլոգիա՝ մուլտիպլեքսավորման հնարավորություններով, բարձր զգայունությամբ և յուրահատկությամբ, և վերավերլուծեցինք ողնուղեղային հեղուկի նմուշները, որոնք մենք գտանք այս 271 կենսամարկերների ենթաբազմություն։ (n = 36): Այս 36 թիրախները ցույց են տալիս PEA-ի AD բազմապատիկի փոփոխությունը, որը սերտորեն կապված է MS-ի վրա հիմնված մեր գտածոների հետ (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), ինչը խիստ ստուգեց մեր համապարփակ MS վերլուծության արդյունքները (Նկար S4): ).
Մեր հինգ խմբերի կողմից ընդգծված կենսաբանական թեմաները՝ սինապտիկ ազդանշանից մինչև էներգետիկ նյութափոխանակություն, բոլորը կապված են AD-ի պաթոգենեզի հետ (1-3): Հետևաբար, այս վահանակները պարունակող բոլոր 15 մոդուլները կապված են ուղեղի պրոտեոմի AD պաթոլոգիայի հետ, որը մենք հայտնաբերեցինք (Նկար 2B): Ամենաուշագրավը մեր գլիալ մոդուլների միջև բարձր դրական պաթոլոգիական հարաբերակցությունն է և մեր ամենամեծ նեյրոնային մոդուլների (M1 և M3) ուժեղ բացասական պաթոլոգիական հարաբերակցությունը: Մեր կրկնվող ուղեղի պրոտեոմի դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծությունը (Նկար S3D) նաև ընդգծում է M5 և M18-ից ստացված գլիալ սպիտակուցները: AsymAD-ում և սիմպտոմատիկ AD-ում ամենաշատ ավելացել են գլիալ սպիտակուցները և M1-ի հետ կապված սինապսները: Այս դիտարկումները ցույց են տալիս, որ 271 ողնուղեղային հեղուկի մարկերները, որոնք մենք հայտնաբերել ենք հինգ խմբերում, կապված են AD ծառի կեղևի հիվանդության գործընթացների հետ, ներառյալ նրանք, որոնք տեղի են ունենում վաղ ասիմպտոմատիկ փուլերում:
Որպեսզի ավելի լավ վերլուծենք պանելային սպիտակուցների ուղղությունը ուղեղում և ողնաշարի հեղուկում, մենք 15 համընկնող մոդուլներից յուրաքանչյուրի համար գծեցինք հետևյալը. սպիտակուց Տարբերությունն արտահայտված է ողնուղեղային հեղուկում (Նկար S5): Ինչպես նշվեց ավելի վաղ, WGCNA-ն օգտագործվում է ուղեղում մոդուլի առատությունը կամ բնորոշ սպիտակուցային արժեքը որոշելու համար (13): Հրաբխի քարտեզն օգտագործվում է ողնուղեղային հեղուկում մոդուլային սպիտակուցների դիֆերենցիալ արտահայտությունը նկարագրելու համար (AD/վերահսկողություն): Այս թվերը ցույց են տալիս, որ հինգ վահանակներից երեքը ցույց են տալիս ուղեղի և ողնաշարի հեղուկի արտահայտման տարբեր միտումներ: Սինապսային վահանակի երկու մոդուլները (M1 և M12) ցույց են տալիս AD ուղեղի առատության մակարդակի նվազում, բայց զգալիորեն համընկնում են AD CSF-ում ավելացված սպիտակուցի հետ (Նկար S5A): Նեյրոնին առնչվող մոդուլները, որոնք պարունակում են մետաբոլոմ (M3 և M38) ցույց են տվել, որ ուղեղի և ողնուղեղային հեղուկի արտահայտման նման օրինաչափությունները անհամապատասխան են (Նկար S5E): Անոթային վահանակը նույնպես ցույց տվեց արտահայտման տարբեր միտումներ, թեև դրա մոդուլները (M6 և M15) չափավոր ավելացան AD ուղեղում և նվազեցին հիվանդ ՔՀՀ-ում (Նկար S5B): Մնացած երկու վահանակները պարունակում են մեծ գլիալ ցանցեր, որոնց սպիտակուցները հետևողականորեն կարգավորվում են երկու բաժանմունքներում (Նկար S5, C և D):
Խնդրում ենք նկատի ունենալ, որ այս միտումները տարածված չեն այս վահանակների բոլոր մարկերների համար: Օրինակ, սինապտիկ վահանակը ներառում է մի քանի սպիտակուցներ, որոնք զգալիորեն կրճատվում են AD ուղեղում և CSF-ում (Նկար S5A): Ցածր կարգավորվող ողնուղեղային հեղուկի այս մարկերներից են M1-ի NPTX2-ը և VGF-ը և M12-ի քրոմոգրանին B-ը: Այնուամենայնիվ, չնայած այս բացառություններին, մեր սինապտիկ մարկերների մեծ մասը բարձրացված է AD ողնուղեղային հեղուկում: Ընդհանուր առմամբ, այս վերլուծությունները կարողացան տարբերակել ուղեղի և ողնուղեղային հեղուկի մակարդակների վիճակագրորեն նշանակալի միտումները մեր հինգ վահանակներից յուրաքանչյուրում: Այս միտումները ընդգծում են AD-ում ուղեղի և ՔՀՀ սպիտակուցի արտահայտման բարդ և հաճախ տարբեր հարաբերությունները:
Այնուհետև մենք օգտագործեցինք MS-ի վերարտադրման բարձր արդյունավետության վերլուծություն (CSF replication 1)՝ մեր 271 կենսամարկերների հավաքածուն նեղացնելու համար առավել խոստումնալից և վերարտադրելի թիրախներին (Նկար 5Ա): CSF պատճենը 1 պարունակում է ընդհանուր առմամբ 96 նմուշ Emory Goizueta ADRC-ից, ներառյալ վերահսկումը, AsymAD և AD խումբը (Աղյուսակ S1A): AD-ի այս դեպքերը բնութագրվում են ճանաչողական թեթև անկմամբ (միջին MoCA, 20.0 ± 3.8) և AD biomarkers-ի փոփոխություններով, որոնք հաստատվել են ողնուղեղային հեղուկում (Աղյուսակ S1A): Հակառակ մեր գտած CSF-ի վերլուծության, այս կրկնօրինակումն իրականացվում է ավելի արդյունավետ և բարձր թողունակությամբ «մեկ կրակոց» MS մեթոդի միջոցով (առանց ֆրակցիոնացման առանց ցանցի), ներառյալ նմուշի պատրաստման պարզեցված արձանագրությունը, որը վերացնում է առանձին նմուշների իմունային քայքայման անհրաժեշտությունը: . Փոխարենը, իմունային անբավարարված «ուժեղացման ալիքն» օգտագործվում է ավելի քիչ առատ սպիտակուցների ազդանշանն ուժեղացնելու համար (37): Չնայած այն նվազեցնում է ընդհանուր պրոտեոմի ծածկույթը, այս մեկ կրակոցի մեթոդը զգալիորեն նվազեցնում է մեքենայի ժամանակը և ավելացնում է TMT պիտակավորված նմուշների քանակը, որոնք կարող են վերլուծվել կենսունակ (17, 38): Ընդհանուր առմամբ, վերլուծությունը հայտնաբերել է 6,487 պեպտիդ, որոնք 96 դեպքերում ընդգրկել են 1,183 պրոտեոմներ: Ինչպես և մեր հայտնաբերած ՔՀՀ վերլուծության դեպքում, միայն նմուշների առնվազն 50%-ում քանակականացված սպիտակուցներն են ներառվել հետագա հաշվարկներում, և տվյալները հետընթաց են գրանցել տարիքի և սեռի ազդեցության համար: Սա հանգեցրեց 792 պրոտեոմների վերջնական քանակականացմանը, որոնց 95%-ը նույնպես հայտնաբերվել է CSF տվյալների հավաքածուում:
(A) Ուղեղի հետ կապված CSF սպիտակուցի թիրախները ստուգված են առաջին կրկնվող CSF կոհորտում և ներառված վերջնական վահանակում (n = 60): (B-ից E) Վահանակի բիոմարկերի մակարդակները (կոմպոզիտային z- միավորներ)՝ չափված CSF-ի կրկնօրինակման չորս խմբերում: Զուգակցված t-թեստերը կամ ANOVA-ն Tukey-ի հետուղղման հետ օգտագործվել են յուրաքանչյուր կրկնվող վերլուծության մեջ առատության փոփոխությունների վիճակագրական նշանակությունը գնահատելու համար: CT, հսկողություն.
Քանի որ մենք հատկապես շահագրգռված ենք ստուգել ուղեղի հետ կապված մեր 271 CSF թիրախները համապարփակ վերլուծության միջոցով, մենք կսահմանափակենք այս կրկնվող պրոտեոմի հետագա հետազոտությունը այս մարկերներով: Այս 271 սպիտակուցներից 100-ը հայտնաբերվել են CSF 1-ի վերարտադրության մեջ: Նկար S6A-ը ցույց է տալիս այս 100 համընկնող մարկերների դիֆերենցիալ արտահայտությունը հսկիչ և AD վերարտադրման նմուշների միջև: Սինապտիկ և մետաբոլիտային հիստոնները ամենաշատը ավելանում են AD-ի ժամանակ, մինչդեռ անոթային սպիտակուցները ամենաշատը նվազում են հիվանդության դեպքում: 100 համընկնող մարկերներից շատերը (n = 70) պահպանում էին փոփոխության նույն ուղղությունը երկու տվյալների հավաքածուներում (Նկար S6B): Ուղեղի հետ կապված CSF-ի այս 70 վավերացված մարկերները (Աղյուսակ S2H) մեծապես արտացոլում են նախկինում դիտարկված վահանակի արտահայտման միտումները, այսինքն՝ անոթային սպիտակուցների ներքև կարգավորումը և բոլոր մյուս վահանակների վերակարգավորումը: Այս 70 վավերացված սպիտակուցներից միայն 10-ն են ցույց տվել AD առատության փոփոխություններ, որոնք հակասում են այս վահանակի միտումներին: Որպեսզի ստեղծենք վահանակ, որը լավագույնս կարտացոլի ուղեղի և ողնուղեղային հեղուկի ընդհանուր միտումը, մենք այս 10 սպիտակուցները բացառեցինք այն հետաքրքրության վահանակից, որը մենք վերջնականապես ստուգեցինք (Նկար 5Ա): Հետևաբար, մեր վահանակը, ի վերջո, ներառում է ընդհանուր առմամբ 60 սպիտակուցներ, որոնք ստուգված են CSF AD երկու անկախ խմբերում՝ օգտագործելով տարբեր նմուշների պատրաստում և MS հարթակի վերլուծություն: Այս վերջնական վահանակների z-score արտահայտման սյուժեները CSF-ի պատճեն 1-ի կառավարման և AD դեպքերում հաստատեցին վահանակի միտումը, որը նկատվում է մեր գտած CSF կոհորտում (Նկար 5B):
Այս 60 սպիտակուցների մեջ կան մոլեկուլներ, որոնք, ինչպես հայտնի է, կապված են AD-ի հետ, ինչպիսիք են օստեոպոնտինը (SPP1), որը պրոբորբոքային ցիտոկին է, որը կապված է AD-ի հետ բազմաթիվ հետազոտություններում (39-41), և GAP43՝ սինապտիկ սպիտակուցը: որը հստակորեն կապված է նեյրոդեգեներացիայի հետ (42): Առավել լիովին հաստատված սպիտակուցները մարկերներն են՝ կապված այլ նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների հետ, ինչպիսիք են ամիոտրոֆիկ կողային սկլերոզը (ALS) կապված սուպերօքսիդ դիսմուտազ 1 (SOD1) և Պարկինսոնի հիվանդության հետ կապված դեզաքարազը (PARK7): Մենք նաև հաստատել ենք, որ շատ այլ մարկերներ, ինչպիսիք են SMOC1-ը և ուղեղով հարուստ մեմբրանի կցման ազդանշանային սպիտակուցը 1 (BASP1), սահմանափակել են նախորդ կապերը նեյրոդեգեներացիայի հետ: Հարկ է նշել, որ CSF-ի պրոտեոմում դրանց ընդհանուր ցածր առատության պատճառով մեզ համար դժվար է օգտագործել այս բարձր արտադրողականության մեկ կրակոցով հայտնաբերման մեթոդը՝ MAPT-ը և AD-ի հետ կապված որոշ այլ սպիտակուցներ հուսալիորեն հայտնաբերելու համար (օրինակ՝ NEFL և NRGN): ) ( 43, 44)։
Այնուհետև մենք ստուգեցինք այս 60 առաջնահերթ պանելային ցուցիչները երեք լրացուցիչ կրկնվող վերլուծություններում: CSF Պատճեն 2-ում մենք օգտագործեցինք մեկ TMT-MS՝ վերլուծելու Emory Goizueta ADRC-ից 297 հսկիչ և AD նմուշների անկախ խումբը (17): CSF 3-ի կրկնօրինակումը ներառում էր հասանելի TMT-MS տվյալների վերավերլուծություն 120 հսկողության և AD հիվանդների կողմից Լոզանից, Շվեյցարիա (45): Յուրաքանչյուր տվյալների բազայում մենք հայտնաբերել ենք 60 առաջնահերթ ցուցիչների ավելի քան երկու երրորդը: Թեև շվեյցարական ուսումնասիրությունն օգտագործել է տարբեր MS հարթակներ և TMT քանակական մեթոդներ (45, 46), մենք խիստ վերարտադրել ենք մեր վահանակի միտումները երկու կրկնվող վերլուծություններում (Նկար 5, C և D, և Աղյուսակներ S2, I և J): Մեր խմբի հիվանդության առանձնահատկությունը գնահատելու համար մենք օգտագործեցինք TMT-MS՝ վերլուծելու չորրորդ կրկնօրինակման տվյալների հավաքածուն (CSF կրկնօրինակում 4), որը ներառում էր ոչ միայն հսկողության (n = 18) և AD (n = 17) դեպքեր, այլ նաև PD ( n = 14)), ALS (n = 18) և ճակատային ժամանակավոր դեմենցիայի (FTD) նմուշներ (n = 11) (Աղյուսակ S1A): Մենք հաջողությամբ քանակականացրել ենք այս խմբի պանելային սպիտակուցների գրեթե երկու երրորդը (60-ից 38-ը): Այս արդյունքները ընդգծում են AD-ին հատուկ փոփոխությունները բոլոր հինգ բիոմարկերային վահանակներում (Նկար 5E և Աղյուսակ S2K): Մետաբոլիտների խմբի աճը ցույց է տվել AD-ի ամենաուժեղ յուրահատկությունը, որին հաջորդում են միելինացումը և գլիալ խումբը: Ավելի փոքր չափով, FTD-ը նաև ցույց է տալիս այս վահանակների միջև աճ, որը կարող է արտացոլել ցանցի նմանատիպ հնարավոր փոփոխությունները (17): Ի հակադրություն, ALS-ը և PD-ն ցույց տվեցին գրեթե նույն միելինացումը, գլիալը և մետաբոլոմային պրոֆիլները, ինչ վերահսկիչ խումբը: Ընդհանուր առմամբ, չնայած նմուշների պատրաստման, MS պլատֆորմի և TMT քանակական մեթոդների տարբերություններին, այս կրկնվող վերլուծությունները ցույց են տալիս, որ մեր առաջնահերթ պանելային մարկերներն ունեն խիստ հետևողական AD-ին հատուկ փոփոխություններ ավելի քան 500 եզակի CSF նմուշներում:
AD-ի նեյրոդեգեներացիան լայնորեն ճանաչվել է կոգնիտիվ ախտանիշների ի հայտ գալուց մի քանի տարի առաջ, ուստի կա AsymAD-ի կենսամարկերների հրատապ անհրաժեշտություն (5, 31): Այնուամենայնիվ, ավելի ու ավելի շատ ապացույցներ ցույց են տալիս, որ AsymAD-ի կենսաբանությունը հեռու է միատարր լինելուց, և ռիսկի և ճկունության բարդ փոխազդեցությունը հանգեցնում է անհատական ​​մեծ տարբերությունների հետագա հիվանդության առաջընթացի մեջ (47): Թեև օգտագործվում է AsymAD-ի դեպքերը բացահայտելու համար, CSF-ի հիմնական բիոմարկերների մակարդակները (Aβ1-42, ընդհանուր tau և p-tau) չեն ապացուցել, որ ի վիճակի չեն հուսալիորեն կանխատեսել, թե ով կանցնի դեմենցիայի (4, 7), ինչը ցույց է տալիս, որ դա կարող է լինել ավելին: անհրաժեշտ է ներառել ամբողջական բիոմարկերային գործիքներ, որոնք հիմնված են ուղեղի ֆիզիոլոգիայի բազմաթիվ ասպեկտների վրա՝ այս բնակչության ռիսկը ճշգրիտ շերտավորելու համար: Հետևաբար, մենք այնուհետև վերլուծեցինք մեր AD-ով վավերացված բիոմարկերների վահանակը CSF-ի պատճեն 1-ի AsymAD պոպուլյացիայի մեջ: Այս 31 AsymAD դեպքերը ցույց տվեցին հիմնական բիոմարկերի աննորմալ մակարդակներ (Aβ1–42/ընդհանուր tau ELISA հարաբերակցությունը, <5.5) և ամբողջական ճանաչողություն (միջին MoCA, 271): ± 2.2) (Աղյուսակ S1A): Բացի այդ, AsymAD-ով բոլոր անհատների կլինիկական թուլամտության գնահատականը 0 է, ինչը ցույց է տալիս, որ ամենօրյա ճանաչողական կամ ֆունկցիոնալ կատարողականի անկման որևէ ապացույց չկա:
Մենք նախ վերլուծել ենք վավերացված վահանակների մակարդակները բոլոր 96 CSF կրկնօրինակներում 1, ներառյալ AsymAD խումբը: Մենք գտանք, որ AsymAD խմբի մի քանի վահանակներ ունեին AD-ի նման առատության զգալի փոփոխություններ, անոթային վահանակը ցույց տվեց նվազման միտում AsymAD-ում, մինչդեռ մյուս բոլոր վահանակները ցույց տվեցին վերընթաց միտում (Նկար 6Ա): Հետևաբար, բոլոր վահանակները ցույց տվեցին բարձր նշանակալի հարաբերակցություն ELISA Aβ1-42-ի և ընդհանուր տաու մակարդակների հետ (Նկար 6B): Ի հակադրություն, խմբի և ՀՀ ԳՆ գնահատականի միջև հարաբերակցությունը համեմատաբար վատ է: Այս վերլուծությունների առավել ցայտուն բացահայտումներից մեկը AsymAD կոհորտում վահանակների առատության մեծ շրջանակն է: Ինչպես ցույց է տրված Նկար 6Ա-ում, AsymAD խմբի վահանակի մակարդակը սովորաբար հատում է վերահսկիչ խմբի և AD խմբի վահանակի մակարդակը՝ ցույց տալով համեմատաբար բարձր փոփոխականություն: AsymAD-ի այս տարասեռությունը հետագա ուսումնասիրելու համար մենք կիրառեցինք Բազմաչափ մասշտաբային (MDS) վերլուծություն 96 CSF կրկնօրինակման 1 դեպքերի համար: MDS վերլուծությունը թույլ է տալիս պատկերացնել դեպքերի նմանությունը տվյալների հավաքածուի որոշակի փոփոխականների հիման վրա: Այս կլաստերային վերլուծության համար մենք օգտագործում ենք միայն այն վավերացված վահանակի մարկերները, որոնք ունեն վիճակագրորեն նշանակալի փոփոխություն (P <0.05, AD/վերահսկում) CSF-ի հայտնաբերման և վերարտադրության 1 պրոտեոմի (n = 29) (Աղյուսակ S2L) մակարդակում: Այս վերլուծությունը ստեղծեց հստակ տարածական խմբավորում մեր հսկողության և AD դեպքերի միջև (Նկար 6C): Ի հակադրություն, AsymAD-ի որոշ դեպքեր հստակորեն խմբավորված են վերահսկիչ խմբում, մինչդեռ մյուսները տեղակայված են AD դեպքերում: AsymAD-ի այս տարասեռությունը հետագայում ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք մեր MDS քարտեզը՝ այս AsymAD դեպքերի երկու խումբ սահմանելու համար: Առաջին խումբը ներառում էր AsymAD դեպքեր, որոնք ավելի մոտ էին հսկողությանը (n = 19), մինչդեռ երկրորդ խումբը բնութագրվում էր AsymAD դեպքերով, որոնք ավելի մոտ են AD-ին (n = 12):
(A) ՔՀՀ-ի բիոմարկերների խմբի արտահայտման մակարդակը (z-score) բոլոր 96 նմուշներում ՔՀՀ կրկնօրինակման 1-ին կոհորտում, ներառյալ AsymAD-ը: Օգտագործվել է շեղումների վերլուծություն Tukey-ի հետուղղման հետ՝ գնահատելու վահանակի առատության փոփոխությունների վիճակագրական նշանակությունը: (B) Վահանակի սպիտակուցների առատության մակարդակի (z-score) հարաբերակցության վերլուծություն MoCA-ի և ընդհանուր tau մակարդակի հետ ELISA Aβ1-42 և CSF պատճեն 1 նմուշներում: Ցուցադրվում է Pearson հարաբերակցության գործակիցը համապատասխան P արժեքի հետ: (C) 96 CSF պատճեն 1-ի դեպքերի MDS-ը հիմնված էր 29 վավերացված վահանակի մարկերների առատության մակարդակների վրա, որոնք զգալիորեն փոխվել են ինչպես հայտնաբերման, այնպես էլ CSF պատճենի 1 տվյալների հավաքածուներում [P <0.05 AD/վերահսկում (CT)]: Այս վերլուծությունը օգտագործվել է AsymAD խումբը վերահսկիչ (n = 19) և AD (n = 12) ենթախմբերի բաժանելու համար: (D) Հրաբխի գծապատկերը ցույց է տալիս CSF-ի վերարտադրման 1 բոլոր սպիտակուցների դիֆերենցիալ արտահայտությունը՝ log2 անգամ փոփոխությամբ (x-առանցք)՝ համեմատած -log10 վիճակագրական P արժեքի երկու AsymAD ենթախմբերի միջև: Վահանակի բիոմարկերները գունավոր են: (E) Ընտրական խմբի կենսամարկերների CSF-ի վերարտադրության 1 առատության մակարդակը տարբեր կերպ է արտահայտված AsymAD ենթախմբերի միջև: Վիճակագրական նշանակությունը գնահատելու համար օգտագործվել է Թուկիի հետճշգրտված շեղումների վերլուծությունը:
Մենք ուսումնասիրեցինք դիֆերենցիալ սպիտակուցային արտահայտությունը այս հսկողության և AD-ի նման AsymAD դեպքերի միջև (Նկար 6D և Աղյուսակ S2L): Ստացված հրաբխի քարտեզը ցույց է տալիս, որ 14 պանելային մարկերներ զգալիորեն փոխվել են երկու խմբերի միջև: Այս մարկերների մեծ մասը սինապսի և մետաբոլոմի անդամներ են: Այնուամենայնիվ, այս խմբին են պատկանում նաև SOD1-ը և միրիստոյլացված ալանինով հարուստ սպիտակուցի կինազ C սուբստրատը (MARCKS), որոնք համապատասխանաբար միելին և գլիալ իմունային խմբերի անդամներ են (Նկար 6, D և E): Անոթային վահանակը նաև ներդրեց երկու մարկեր, որոնք զգալիորեն կրճատվեցին AD-ի նման AsymAD խմբում, ներառյալ AE կապող սպիտակուցը 1 (AEBP1) և կոմպլեմենտ ընտանիքի անդամ C9: ELISA AB1-42 (P = 0.38) և p-tau (P = 0.28) վերահսկման և AD-նման AsymAD ենթախմբերի միջև էական տարբերություն չկար, բայց իսկապես զգալի տարբերություն կար ընդհանուր տաուի մակարդակում (P = 0.0031): ) (նկ. S7): Կան մի քանի պանելային ցուցիչներ, որոնք ցույց են տալիս, որ AsymAD երկու ենթախմբերի միջև փոփոխություններն ավելի նշանակալի են, քան ընդհանուր tau մակարդակները (օրինակ՝ YWHAZ, SOD1 և MDH1) (Նկար 6E): Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ մեր վավերացված վահանակը կարող է պարունակել բիոմարկերներ, որոնք կարող են ենթատիպային և պոտենցիալ ռիսկի շերտավորումը ասիմպտոմատիկ հիվանդությամբ հիվանդների համար:
Համակարգի վրա հիմնված բիոմարկերային գործիքների հրատապ անհրաժեշտություն կա՝ ավելի լավ չափելու և թիրախավորելու AD-ի հետևում գտնվող տարբեր պաթոֆիզիոլոգիան: Ակնկալվում է, որ այս գործիքները ոչ միայն կփոխեն մեր AD ախտորոշիչ շրջանակը, այլ նաև կխթանեն հիվանդին հատուկ բուժման արդյունավետ ռազմավարությունների ընդունումը (1, 2): Այդ նպատակով մենք կիրառեցինք անաչառ համապարփակ պրոտեոմիկայի մոտեցում AD ուղեղի և CSF-ի նկատմամբ՝ բացահայտելու վեբ վրա հիմնված CSF կենսամարկերները, որոնք արտացոլում են ուղեղի վրա հիմնված պաթոֆիզիոլոգիայի լայն շրջանակ: Մեր վերլուծությունը ստեղծեց հինգ CSF բիոմարկերային վահանակներ, որոնք (i) արտացոլում են սինապսները, արյան անոթները, միելինը, իմունային և նյութափոխանակության դիսֆունկցիան. (ii) ցուցադրել ուժեղ վերարտադրելիություն տարբեր MS հարթակներում. (iii) Ցույց տալ առաջադեմ հիվանդությանը բնորոշ փոփոխություններ AD-ի վաղ և ուշ փուլերում: Ընդհանուր առմամբ, այս բացահայտումները խոստումնալից քայլ են AD հետազոտության և կլինիկական կիրառությունների համար բազմազան, հուսալի, վեբ-կողմնորոշված ​​բիոմարկերային գործիքների զարգացման ուղղությամբ:
Մեր արդյունքները ցույց են տալիս AD-ի ուղեղի ցանցի պրոտեոմի խիստ պահպանված կազմակերպությունը և աջակցում են դրա օգտագործմանը որպես համակարգի վրա հիմնված բիոմարկերի մշակման խարիսխ: Մեր վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ երկու անկախ TMT-MS տվյալների հավաքածուներ, որոնք պարունակում են AD և AsymAD ուղեղներ, ունեն ուժեղ մոդուլյարություն: Այս բացահայտումները ընդլայնում են մեր նախորդ աշխատանքը՝ ցույց տալով ավելի քան 2000 ուղեղի հյուսվածքների հզոր մոդուլների պահպանումը ճակատային, պարիետալ և ժամանակավոր կեղևի բազմաթիվ անկախ խմբերից (17): Այս կոնսենսուսային ցանցը արտացոլում է հիվանդության հետ կապված տարբեր փոփոխություններ, որոնք նկատվում են ընթացիկ հետազոտություններում, ներառյալ գլիալով հարուստ բորբոքային մոդուլների ավելացումը և նեյրոններով հարուստ մոդուլների նվազումը: Ինչպես ընթացիկ հետազոտությունը, այս լայնածավալ ցանցը նույնպես առանձնանում է AsymAD-ի զգալի մոդուլային փոփոխություններով, որոնք ցույց են տալիս տարբեր նախակլինիկական պաթոֆիզիոլոգիա (17):
Այնուամենայնիվ, այս խիստ պահպանողական համակարգի վրա հիմնված շրջանակում կա ավելի նուրբ կենսաբանական տարասեռություն, հատկապես AD-ի վաղ փուլերում գտնվող անհատների շրջանում: Մեր բիոմարկերների վահանակը կարող է պատկերել երկու ենթախումբ AsymAD-ում, որոնք ցույց են տալիս CSF բազմաթիվ մարկերների էական դիֆերենցիալ արտահայտությունը: Մեր խումբը կարողացավ ընդգծել այս երկու ենթախմբերի կենսաբանական տարբերությունները, որոնք ակնհայտ չէին AD-ի հիմնական կենսամարկերների մակարդակում: Համեմատած հսկիչ խմբի հետ՝ այս AsymAD անհատների Aβ1-42/ընդհանուր տաու գործակիցները աննորմալ ցածր էին: Այնուամենայնիվ, AsymAD երկու ենթախմբերի միջև էապես տարբերվում էին միայն տաուի ընդհանուր մակարդակները, մինչդեռ Aβ1-42 և p-tau մակարդակները մնացին համեմատաբար համեմատելի: Քանի որ CSF-ի բարձր տաու-ն, կարծես, ճանաչողական ախտանիշների ավելի լավ կանխատեսող է, քան Aβ1-42 մակարդակները (7), մենք կասկածում ենք, որ երկու AsymAD խմբերը կարող են հիվանդության առաջընթացի տարբեր ռիսկեր ունենալ: Հաշվի առնելով մեր AsymAD-ի ընտրանքի սահմանափակ չափը և երկայնական տվյալների բացակայությունը, այս եզրակացությունները վստահորեն անելու համար անհրաժեշտ է լրացուցիչ հետազոտություն: Այնուամենայնիվ, այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ համակարգի վրա հիմնված CSF վահանակը կարող է ուժեղացնել հիվանդության ասիմպտոմատիկ փուլում անհատներին արդյունավետորեն շերտավորելու մեր ունակությունը:
Ընդհանուր առմամբ, մեր բացահայտումները հաստատում են բազմաթիվ կենսաբանական գործառույթների դերը AD-ի պաթոգենեզում: Այնուամենայնիվ, անկանոն էներգիայի նյութափոխանակությունը դարձավ մեր բոլոր հինգ վավերացված պիտակավորման վահանակների կարևոր թեման: Նյութափոխանակության սպիտակուցները, ինչպիսիք են հիպոքսանտին-գուանին ֆոսֆորիբոսիլտրանսֆերազը 1 (HPRT1) և լակտատդեհիդրոգենազ A (LDHA), ամենաուժեղ վավերացված սինապտիկ բիոմարկերներն են, ինչը ցույց է տալիս, որ AD CSF-ի աճը շատ վերարտադրելի սեռ է: Մեր արյան անոթները և գլիալ պանելները պարունակում են նաև մի քանի մարկեր, որոնք ներգրավված են օքսիդատիվ նյութերի նյութափոխանակության մեջ: Այս բացահայտումները համահունչ են այն հիմնական դերին, որ նյութափոխանակության գործընթացները խաղում են ամբողջ ուղեղում, ոչ միայն բավարարելու նեյրոնների բարձր էներգիայի պահանջարկը, այլև բավարարելու աստղասիտների և այլ գլիալ բջիջների էներգիայի բարձր պահանջարկը (17, 48): Մեր արդյունքները հաստատում են աճող ապացույցն այն մասին, որ ռեդոքս պոտենցիալի փոփոխությունները և էներգիայի ուղիների ընդհատումը կարող են լինել հիմնական կապը մի քանի հիմնական գործընթացների միջև, որոնք ներգրավված են AD-ի պաթոգենեզում, ներառյալ միտոքոնդրիալ խանգարումները, գլիալ միջնորդավորված բորբոքումները և անոթային վնասը (49): Բացի այդ, մետաբոլիկ ողնուղեղային հեղուկի բիոմարկերները պարունակում են մեծ քանակությամբ դիֆերենցիալ հարուստ սպիտակուցներ մեր վերահսկողության և AD-ի նման AsymAD ենթախմբերի միջև, ինչը ենթադրում է, որ այս էներգիայի և ռեդոքս ուղիների խախտումը կարող է կարևոր լինել հիվանդության նախակլինիկական փուլում:
Ուղեղի և ողնուղեղային հեղուկի պանելների տարբեր միտումները, որոնք մենք դիտարկել ենք, նույնպես հետաքրքիր կենսաբանական հետևանքներ ունեն: Նեյրոններով հարուստ սինապսները և մետաբոլոմները ցույց են տալիս ուղեղի AD-ի մակարդակի նվազում և ողնուղեղային հեղուկի առատության ավելացում: Հաշվի առնելով, որ նեյրոնները հարուստ են էներգիա արտադրող միտոքոնդրիաներով սինապսներում՝ էներգիա ապահովելու իրենց բազմաթիվ մասնագիտացված ազդանշանների համար (50), ակնկալվում է, որ այս երկու նեյրոնային խմբերի արտահայտման պրոֆիլների նմանությունը: Նեյրոնների կորուստը և վնասված բջիջների արտամղումը կարող են բացատրել ուղեղի և CSF վահանակի այս միտումները հետագա հիվանդության մեջ, բայց դրանք չեն կարող բացատրել վաղ պանելային փոփոխությունները, որոնք մենք դիտում ենք (13): Վաղ ասիմպտոմատիկ հիվանդության այս բացահայտումների հնարավոր բացատրություններից մեկը աննորմալ սինապտիկ էտումն է: Մկների մոդելների նոր ապացույցները ցույց են տալիս, որ միկրոգլիայի միջնորդավորված սինապտիկ ֆագոցիտոզը կարող է աննորմալ ակտիվանալ AD-ում և հանգեցնել ուղեղի սինապսի վաղ կորստի (51): Այս դեն նետված սինապտիկ նյութը կարող է կուտակվել CSF-ում, այդ իսկ պատճառով մենք նկատում ենք CSF-ի աճը նեյրոնային վահանակում: Իմունային միջնորդավորված սինապտիկ էտումը կարող է նաև մասամբ բացատրել գլիալ սպիտակուցների ավելացումը, որը մենք դիտում ենք ուղեղում և ողնուղեղային հեղուկում հիվանդության ողջ ընթացքում: Ի լրումն սինապտիկ էտման, էկզոցիտային ուղու ընդհանուր աննորմալությունները կարող են նաև հանգեցնել ուղեղի և CSF-ի նեյրոնային մարկերների տարբեր արտահայտման: Մի շարք ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ AD ուղեղի պաթոգենեզում էկզոսոմների պարունակությունը փոխվել է (52): Արտբջջային ուղին նույնպես ներգրավված է Aβ-ի տարածման մեջ (53, 54): Հարկ է նշել, որ էկզոսոմային սեկրեցիայի ճնշումը կարող է նվազեցնել AD-ի նման պաթոլոգիան AD տրանսգենային մկների մոդելներում (55):
Միևնույն ժամանակ, անոթային պանելում գտնվող սպիտակուցը ցույց է տվել AD ուղեղի չափավոր աճ, բայց զգալիորեն նվազել է CSF-ում: Արյան ուղեղային արգելքի (BBB) ​​դիսֆունկցիան կարող է մասամբ բացատրել այս բացահայտումները: Մարդկանց հետմահու բազմաթիվ անկախ հետազոտություններ ցույց են տվել BBB-ի քայքայումը AD-ում (56, 57): Այս ուսումնասիրությունները հաստատեցին էնդոթելի բջիջների այս ամուր փակ շերտը շրջապատող տարբեր աննորմալ գործողություններ, ներառյալ ուղեղի մազանոթների արտահոսքը և արյան միջոցով փոխանցվող սպիտակուցների պերիվասկուլյար կուտակումը (57): Սա կարող է պարզ բացատրություն տալ ուղեղի անոթային սպիտակուցների բարձրացման համար, սակայն այն չի կարող լիովին բացատրել ողնուղեղային հեղուկում այս նույն սպիտակուցների սպառումը: Հնարավորություններից մեկն այն է, որ կենտրոնական նյարդային համակարգը ակտիվորեն մեկուսացնում է այս մոլեկուլները՝ լուծելու բորբոքման և օքսիդատիվ սթրեսի ավելացման խնդիրը: Այս վահանակում CSF-ի որոշ ամենածանր սպիտակուցների նվազումը, հատկապես նրանց, ովքեր ներգրավված են լիպոպրոտեինների կարգավորման մեջ, կապված է բորբոքման վնասակար մակարդակների արգելակման և ռեակտիվ թթվածնի տեսակների նեյրոպաշտպանիչ գործընթացի հետ: Սա ճիշտ է պարոքսոնազ 1-ի (PON1) համար՝ լիպոպրոտեին կապող ֆերմենտ, որը պատասխանատու է արյան շրջանառության մեջ օքսիդատիվ սթրեսի մակարդակը նվազեցնելու համար (58, 59): Ալֆա-1-միկրոգլոբուլին/բիկունի պրեկուրսորը (AMBP) անոթային խմբի ևս մեկ զգալիորեն նվազող մարկեր է: Այն լիպիդային փոխադրող բիկունինի նախադրյալն է, որը նույնպես մասնակցում է բորբոքման ճնշմանը և նյարդաբանական պաշտպանությանը (60, 61):
Չնայած տարբեր հետաքրքիր վարկածներին, կենսաքիմիական հիվանդության մեխանիզմներն ուղղակիորեն հայտնաբերելու անկարողությունը բացահայտումների վրա հիմնված պրոտեոմիկայի վերլուծության հայտնի սահմանափակում է: Հետևաբար, հետագա հետազոտություններն անհրաժեշտ են՝ վստահորեն սահմանելու այս բիոմարկերային վահանակների հիմքում ընկած մեխանիզմները: MS-ի վրա հիմնված կլինիկական վերլուծության զարգացման ուղղությամբ շարժվելու համար ապագա ուղղությունը պահանջում է նաև լայնածավալ բիոմարկերների ստուգման նպատակային քանակական մեթոդների կիրառում, ինչպիսիք են ընտրովի կամ զուգահեռ ռեակցիաների մոնիտորինգը (62): Մենք վերջերս օգտագործեցինք ռեակցիայի զուգահեռ մոնիտորինգ (63)՝ հաստատելու համար այստեղ նկարագրված ՔՀՀ սպիտակուցի փոփոխություններից շատերը: Վահանակի մի քանի առաջնահերթ թիրախներ քանակականացվում են զգալի ճշգրտությամբ, այդ թվում՝ YWHAZ, ALDOA և SMOC1, որոնք համապատասխանաբար քարտեզագրվում են մեր սինապսի, նյութափոխանակության և բորբոքման վահանակների վրա (63): Անկախ տվյալների հավաքագրումը (DIA) և MS-ի վրա հիմնված այլ ռազմավարությունները կարող են նաև օգտակար լինել թիրախային ստուգման համար: Bud et al. (64) Վերջերս ապացուցվեց, որ զգալի համընկնում կա մեր CSF-ի հայտնաբերման տվյալների հավաքածուում հայտնաբերված AD կենսամարկերների և անկախ DIA-MS տվյալների հավաքածուի միջև, որը բաղկացած է եվրոպական երեք տարբեր խմբերի մոտ 200 CSF նմուշներից: Այս վերջին ուսումնասիրությունները աջակցում են մեր վահանակների ներուժին՝ վերածվելու MS-ի վրա հիմնված հուսալի հայտնաբերման: Ավանդական հակամարմինների և ապտամերների վրա հիմնված հայտնաբերումը նույնպես կարևոր է AD-ի հիմնական կենսամարկերների հետագա զարգացման համար: ՔՀՀ-ի ցածր առատության պատճառով ավելի դժվար է հայտնաբերել այս բիոմարկերները՝ օգտագործելով բարձր թողունակության MS մեթոդները: NEFL-ը և NRGN-ը ցածր առատությամբ CSF բիոմարկերների երկու նման օրինակներ են, որոնք քարտեզագրված են վահանակի վրա մեր համապարփակ վերլուծության մեջ, բայց չեն կարող հուսալիորեն հայտնաբերվել՝ օգտագործելով մեր միասնական MS ռազմավարությունը: Բազմաթիվ հակամարմինների վրա հիմնված թիրախավորման ռազմավարությունները, ինչպիսիք են PEA-ն, կարող են նպաստել այս մարկերների կլինիկական վերափոխմանը:
Ընդհանուր առմամբ, այս ուսումնասիրությունը տրամադրում է պրոտեոմիկայի եզակի մոտեցում՝ տարբեր համակարգերի վրա հիմնված CSF AD բիոմարկերների նույնականացման և ստուգման համար: Այս մարկերային վահանակների օպտիմիզացումը AD-ի լրացուցիչ խմբերում և MS հարթակներում կարող է խոստումնալից առաջացնել AD-ի ռիսկի շերտավորումն ու բուժումը: Ուսումնասիրությունները, որոնք գնահատում են այս վահանակների երկայնական մակարդակը ժամանակի ընթացքում, նույնպես կարևոր նշանակություն ունեն՝ որոշելու համար, թե որ մարկերների համակցությունն է լավագույնս շերտավորում վաղ հիվանդության ռիսկը և հիվանդության ծանրության փոփոխությունները:
Բացառությամբ ՔՀՀ-ի կողմից պատճենված 3 նմուշների, այս հետազոտության մեջ օգտագործված ՔՀՀ-ի բոլոր նմուշները հավաքվել են Emory ADRC-ի կամ սերտորեն կապված հետազոտական ​​հաստատությունների հովանու ներքո: Այս պրոտեոմիկայի ուսումնասիրություններում օգտագործվել են Emory CSF-ի նմուշների չորս հավաքածու: Պարզվել է, որ CSF խումբը պարունակում է նմուշներ 20 առողջ վերահսկիչներից և 20 AD հիվանդներից: CSF-ի պատճեն 1-ը ներառում է 32 առողջ հսկողության, 31 AsymAD անհատների և 33 AD անհատների նմուշներ: CSF 2-րդ պատճենը պարունակում է 147 հսկիչ և 150 AD նմուշ: Բազմաթիվ հիվանդությունների CSF-ի կրկնօրինակման 4 խումբը ներառում էր 18 վերահսկիչ, 17 AD, 19 ALS, 13 PD և 11 FTD նմուշներ: Էմորիի համալսարանի ինստիտուցիոնալ վերանայման խորհրդի կողմից հաստատված համաձայնագրի համաձայն՝ Էմորիի ուսումնասիրության բոլոր մասնակիցները ստացան տեղեկացված համաձայնություն: Համաձայն 2014 թվականի Ալցհեյմերի կենտրոնների ծերացման ազգային ինստիտուտի լավագույն փորձի ուղեցույցների (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), ողնուղեղային հեղուկը հավաքվել և պահպանվել է գոտկային պունկցիայի միջոցով: Control և AsymAD և AD հիվանդները ստացել են ստանդարտացված ճանաչողական գնահատում Emory Cognitive Neurology Clinic-ում կամ Goizueta ADRC-ում: Նրանց ողնուղեղային հեղուկի նմուշները փորձարկվել են INNO-BIA AlzBio3 Luminex-ի կողմից ELISA Aβ1-42-ի, ընդհանուր tau և p-tau վերլուծության համար (65): ELISA-ի արժեքներն օգտագործվում են սուբյեկտների ախտորոշիչ դասակարգմանն աջակցելու համար՝ հիմնված AD կենսամարկերի կտրման սահմանված չափանիշների վրա (66, 67): Հիմնական ժողովրդագրական և ախտորոշիչ տվյալները ՔՀՀ այլ ախտորոշումների համար (FTD, ALS և PD) նույնպես ստացվում են Emory ADRC-ից կամ հարակից հետազոտական ​​հաստատություններից: Emory CSF-ի այս դեպքերի ամփոփ դեպքի մետատվյալները կարելի է գտնել Աղյուսակ S1A-ում: Շվեյցարական CSF-ի կրկնօրինակման 3 խմբի բնութագրերը նախկինում հրապարակվել են (45):
CSF-ը գտավ նմուշը: ՔՀՀ տվյալների հավաքածուի մեր հայտնաբերման խորությունը մեծացնելու նպատակով, բարձր առատությամբ սպիտակուցների իմունային սպառումը կատարվել է նախքան տրիպսինացումը: Կարճ ասած, 130 մկլ CSF 40 անհատական ​​CSF նմուշից և հավասար ծավալ (130 μl) բարձր ընտրված Top14 առատությամբ սպիտակուցի սպառման խեժ (Thermo Fisher Scientific, A36372) տեղադրվել են սենյակում պտտվող սյունակում (Thermo Fisher Scientific, A89868): ջերմաստիճանի ինկուբացիա): 15 րոպե պտտելուց հետո ցենտրիֆուգեք նմուշը 1000 գ-ում 2 րոպե: Կեղտաջրերի նմուշը խտացնելու համար օգտագործվել է 3K գերկենտրոնախույս զտիչ սարք (Millipore, UFC500396)՝ 30 րոպե ցենտրիֆուգելով 14000 գ-ում: Նմուշի բոլոր ծավալները նոսրացրեք մինչև 75 մկլ ֆոսֆատով բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթով: Սպիտակուցի կոնցենտրացիան գնահատվել է բիցինխոնինաթթվի (BCA) մեթոդով՝ ըստ արտադրողի արձանագրության (Thermo Fisher Scientific): Բոլոր 40 նմուշներից իմունային անբավարարված CSF-ը (60 մկլ) մարսվել է լիզիլ էնդոպեպտիդազով (LysC) և տրիպսինով: Մի խոսքով, նմուշը կրճատվել և ալկիլացվել է 1,2 մկլ 0,5 Մ տրիս-2(-կարբոքսիէթիլ)-ֆոսֆինով և 3 մկլ 0,8 Մ քլորոացետամիդով 90°C-ում 10 րոպե, այնուհետև ջրային բաղնիքում 15 րոպե հնչեցնել: Նմուշը նոսրացվել է 193 մկլ 8 Մ միզանյութով [8 Մ միզանյութ և 100 մՄ NaHPO4 (pH 8,5)] մինչև 6 մ միզանյութի վերջնական կոնցենտրացիան: LysC (4,5 մկգ; Wako) օգտագործվում է սենյակային ջերմաստիճանում գիշերային մարսողության համար: Այնուհետև նմուշը նոսրացրել են մինչև 1 մ միզանյութ 50 մՄ ամոնիումի բիկարբոնատով (ABC) (68): Ավելացրեք հավասար քանակությամբ (4,5 մկգ) տրիպսին (Promega), ապա նմուշը 12 ժամ ինկուբացրեք: Թթվացնել մարսված պեպտիդային լուծույթը մինչև 1% մածուցիկ թթվի (FA) և 0,1% տրիֆտորքացախաթթվի (TFA) վերջնական կոնցենտրացիան (66), այնուհետև աղազերծել 50 մգ Sep-Pak C18 սյունակով (Ջրեր), ինչպես նկարագրված է վերևում (25): . Այնուհետև պեպտիդը զտվել է 1 մլ 50% ացետոնիտրիլի (ACN) մեջ: Սպիտակուցների քանակական հաշվարկը խմբաքանակներում (25) ստանդարտացնելու համար 100 մկլ մասնաբաժինները բոլոր 40 CSF նմուշներից համակցվել են՝ ստեղծելու խառը նմուշ, որն այնուհետև բաժանվել է հինգ համաշխարհային ներքին ստանդարտի (GIS) (48) նմուշների: Բոլոր առանձին նմուշները և համակցված ստանդարտները չորանում են գերարագ վակուումով (Labconco):
CSF-ը պատճենում է նմուշը: Դեյոնը և գործընկերները նախկինում նկարագրել են CSF-ի կրկնօրինակի 3 նմուշների իմունային սպառումը և մարսողությունը (45, 46): Մնացած կրկնօրինակ նմուշները առանձին-առանձին իմունային թուլացած չէին: Մարսեք այս չհեռացված նմուշները տրիպսինում, ինչպես նկարագրված է նախկինում (17): Յուրաքանչյուր կրկնվող վերլուծության համար 120 մկլ լուծված պեպտիդի չափաբաժինները յուրաքանչյուր նմուշից հավաքվել են միասին և բաժանվել հավասար ծավալների՝ որպես TMT պիտակավորված գլոբալ ներքին ստանդարտ (48): Բոլոր առանձին նմուշները և համակցված ստանդարտները չորանում են գերարագ վակուումով (Labconco): Ցածր առատությամբ CSF սպիտակուցի ազդանշանն ուժեղացնելու համար, յուրաքանչյուր նմուշից 125 մկլ միավորելով, յուրաքանչյուր կրկնվող վերլուծության համար պատրաստվեց «ուժեղացված» նմուշ [այսինքն՝ կենսաբանական նմուշ, որը կրկնօրինակում է հետազոտության նմուշը, բայց հասանելի քանակությունը՝ շատ ավելի մեծ (37, 69)] միաձուլվել է խառը CSF նմուշի մեջ (17): Խառը նմուշն այնուհետև իմունային հեռացվեց՝ օգտագործելով 12 մլ High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), մարսվեց, ինչպես նկարագրված է վերևում, և ներառվեց հետագա բազմակի TMT պիտակավորման մեջ: